Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم نهجا خطوة بخطوة لتحديد ومعالجة المشكلات الأكثر شيوعا المرتبطة بالمسافات البادئة الدقيقة للقوة الذرية. نحن نمثل المشاكل الناشئة في نباتات الغضاريف المفصلية البشرية الأصلية التي تتميز بدرجات مختلفة من التنكس الناجم عن هشاشة العظام.

Abstract

لا شك أن مجهر القوة الذرية (AFM) هو حاليا أحد أقوى التقنيات وأكثرها فائدة لتقييم الإشارات الدقيقة وحتى النانوية في المجال البيولوجي. ومع ذلك ، كما هو الحال مع أي نهج مجهري آخر ، يمكن أن تنشأ تحديات منهجية. على وجه الخصوص ، يمكن أن تؤدي خصائص العينة وإعداد العينة ونوع الأداة ومسبار المسافة البادئة إلى قطع أثرية غير مرغوب فيها. في هذا البروتوكول ، نمثل هذه المشكلات الناشئة على نباتات الغضروف المفصلي الصحية وكذلك العظمية. تحقيقا لهذه الغاية ، نعرض أولا من خلال نهج خطوة بخطوة كيفية إنشاء وتصنيف وتصنيف أقراص الغضروف المفصلية خارج الجسم الحي بصريا وفقا لمراحل مختلفة من التنكس عن طريق تصوير مضان الفسيفساء 2D الكبير لنباتات الأنسجة بأكملها. تتمثل القوة الرئيسية للنموذج خارج الجسم الحي في أنه يشتمل على غضروف بشري قديم وأصلي يسمح بالتحقيق في التغيرات المرتبطة بهشاشة العظام من البداية المبكرة إلى التقدم. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا عرض المزالق الشائعة في إعداد الأنسجة ، وكذلك إجراء AFM الفعلي مع تحليل البيانات اللاحق. نوضح كيف يمكن للخطوات الأساسية ولكن الحاسمة مثل إعداد العينات ومعالجتها ، وخصائص العينة الطبوغرافية الناتجة عن الانحطاط المتقدم ، وتفاعل طرف العينة أن تؤثر على الحصول على البيانات. نخضع أيضا للتدقيق المشاكل الأكثر شيوعا في AFM ونصف ، حيثما أمكن ، كيفية التغلب عليها. إن معرفة هذه القيود ذات أهمية قصوى للحصول على البيانات الصحيحة وتفسيرها ، وفي النهاية تضمين النتائج في سياق علمي واسع.

Introduction

نظرا للحجم المتقلص باستمرار للأجهزة والأنظمة الإلكترونية ، اكتسب التطور السريع للتكنولوجيا والمعدات القائمة على الميكرو والنانو زخما. أحد هذه الأجهزة هو مجهر القوة الذرية (AFM) ، والذي يمكنه مسح الأسطح البيولوجية واسترداد المعلومات الطبوغرافية أو الميكانيكية الحيوية على مقياس نانو وميكرومتر 1,2. من بين ميزاتها الواسعة ، يمكن تشغيل هذه الأداة كأداة صغيرة وكذلك نانو إندينتر للحصول على معلومات حول الخواص الميكانيكية للأنظمة البيولوجيةالمختلفة 3،4،5،6. يتم جمع البيانات عن طريق الاتصال المادي مع السطح من خلال مسبار ميكانيكي ، والذي يمكن أن يكون صغيرا مثل حوالي 1 نانومتر عند طرفه7. ثم يتم عرض التشوه الناتج للعينة بناء على عمق المسافة البادئة لطرف الكابولي والقوة المطبقة على العينة8.

هشاشة العظام (OA) هو مرض مزمن تنكسي طويل الأمد يتميز بتدهور الغضروف المفصلي في المفاصل والأنسجة المحيطة ، مما قد يؤدي إلى التعرض الكامل لأسطح العظام. عبء الزراعة العضوية كبير. وفي الوقت الراهن، يعاني نصف جميع النساء وثلث جميع الرجال الذين تبلغ أعمارهم 65 عاما أو أكثر من الزراعة العضوية9. تحدد الصدمات والسمنة والميكانيكا الحيوية المتغيرة الناتجة عن المفصل10 تنكس الغضروف المفصلي ، والذي ينظر إليه على أنه نتيجة نهائية شائعة. افترضت الدراسة الرائدة ل Ganz et al. أن الخطوات المبكرة لعملية الزراعة العضوية قد تتضمن الخواص الميكانيكية الحيوية للغضروف11 ، ومنذ ذلك الحين أكد الباحثون هذه الفرضية12. وبالمثل ، من المقبول عموما أن يتم تنسيق الخصائص الميكانيكية الحيوية للأنسجة وظيفيا من خلال التنظيم الفائق بالإضافة إلى الحديث المتبادل بين الخلايا والخلايا ومصفوفة الخلية. أي تعديلات يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الأداء الميكانيكي الحيوي الكلي للأنسجة13. حتى الآن ، يعد تشخيص هشاشة العظام سريريا ويستند إلى التصوير الشعاعي للفيلم العادي14. هذا النهج ذو وجهين: أولا ، عدم وجود عتبة قطع تنكسية محددة لصياغة تشخيص هشاشة العظام يجعل من الصعب تحديد الحالة ، وثانيا ، تفتقر طرق التصوير إلى الحساسية والتوحيد القياسي ولا يمكنها اكتشاف تلف الغضروف الموضعي15،16،17. تحقيقا لهذه الغاية ، فإن تقييم الخواص الميكانيكية للغضروف له ميزة حاسمة أنه يصف المعلمة التي تتغير خلال مسار الزراعة العضوية بغض النظر عن مسببات المرض ولها تأثير مباشر على وظائف الأنسجة في مرحلة مبكرة جدا. تقيس أدوات المسافة البادئة القوة التي يقاوم بها النسيج المسافة البادئة. هذا ، في الواقع ، ليس مفهوما جديدا. تعود أقدم الدراسات إلى ثمانينيات و تسعينيات القرن العشرين. في هذه الفترة ، اقترحت العديد من الدراسات أن أدوات المسافة البادئة المصممة للقياسات بالمنظار للغضروف المفصلي يمكن أن تكون مناسبة تماما للكشف عن التغيرات التنكسية في الغضروف. حتى قبل 30 عاما ، تمكنت بعض الدراسات من إثبات أن أدوات المسافة البادئة كانت قادرة على اكتشاف التغيرات في الجسم الحي في سطح الغضروف أثناء تنكس الأنسجة عن طريق إجراء قياسات صلابة الانضغاط أثناء تنظير المفصل18،19،20.

توفر المسافة البادئة AFM (AFM-IT) للغضروف المفصلي معلومات حول خاصية ميكانيكية محورية للأنسجة ، وهي الصلابة. هذه معلمة ميكانيكية تصف العلاقة بين الحمل المطبق غير المدمر والتشوه الناتج لمنطقة الأنسجة البادئة21. لقد ثبت أن AFM-IT قادر على تحديد التعديلات المعتمدة على العمر في الصلابة في شبكات الكولاجين غير المتأثرة مجهريا ، وبالتالي التمييز بين التغيرات المرضية المرتبطة ببداية الزراعة العضوية (الدرجة 0 على مقياس Outerbridge في الغضروف المفصلي)22. لقد أظهرنا سابقا أن AFM-ITs ، على أساس تنظيم الخلايا الغضروفية المكانية كمؤشر حيوي قائم على الصور لتنكس الغضروف المبكر ، لا يسمح فقط بالقياس الكمي ولكن أيضا تحديد التغيرات الميكانيكية التنكسية المبكرة. وقد تم تأكيد هذه النتائج بالفعل من قبل الآخرين23,24. وبالتالي ، يعمل AFM-IT كأداة مثيرة للاهتمام لتشخيص وتحديد التغيرات التنكسية المبكرة. يمكن قياس هذه التغييرات بالفعل على المستوى الخلوي ، وإعادة تشكيل فهم عملية الفيزيولوجيا المرضية OA.

في هذا البروتوكول ، نعرض إجراء تصنيف نسيجي وميكانيكي حيوي كامل لنباتات الغضروف المفصلي ، من تحضير نبات الغضروف الأصلي إلى الحصول على بيانات AFM ومعالجتها. من خلال نهج خطوة بخطوة ، نوضح كيفية إنشاء أنسجة الغضاريف المفصلية وتصنيفها وتصنيفها بصريا وفقا لمراحل مختلفة من التنكس عن طريق تصوير الفسيفساء الكبير 2D ، متبوعا بمسافات بادئة micro-AFM.

على الرغم من أن AFM-IT ، حاليا ، هي واحدة من أكثر الأدوات حساسية لقياس التغيرات الميكانيكية الحيوية في الغضروف7 ، مثل أي تقنية مفيدة أخرى ، إلا أن لها قيودا وخصائص عملية25 يمكن أن تؤدي إلى الحصول على بيانات خاطئة. تحقيقا لهذه الغاية ، نخضع للتدقيق المشاكل الأكثر شيوعا التي تنشأ أثناء قياسات AFM لنباتات الغضاريف ونصف ، حيثما أمكن ، كيفية تقليلها أو التغلب عليها. وتشمل هذه الجوانب الطبوغرافية للعينات والصعوبات في تثبيتها في بيئة متوافقة مع AFM ، والخصائص الفيزيائية لسطح الأنسجة ، والصعوبات الناتجة في إجراء قياسات AFM على هذه الأسطح. كما يتم تقديم أمثلة على منحنيات مسافة القوة الخاطئة ، مع التركيز على الظروف التي قد تسببها. كما تمت مناقشة القيود الإضافية المتأصلة في هندسة الطرف الكابولي واستخدام نموذج هيرتز لتحليل البيانات.

Protocol

تم استخدام اللقمة الفخذية التي تم جمعها من المرضى الذين يخضعون لتقويم مفاصل الركبة الكلي في مستشفى جامعة توبنغن ، ألمانيا. تم تضمين عينات الغضروف المفصلي فقط من المرضى الذين يعانون من أمراض المفاصل التنكسية وما بعد الصدمة في هذه الدراسة. تم الحصول على موافقة اللجنة الأخلاقية الإدارية والمؤسسية والمحلية قبل بدء الدراسة (المشروع رقم 674/2016BO2). تم تلقي موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى قبل المشاركة.

ملاحظة: يرد مخطط انسيابي لخطوات التجربة بترتيبها الزمني في الشكل 1.

1. معالجة الأنسجة وتوليد أقراص الغضاريف

  1. تحضير الأنسجة
    1. بعد الاستئصال بعد الجراحة ، ضع عينات الغضروف في وعاء مملوء بوسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 5٪ (v / v) البنسلين والستربتومايسين. تأكد من غمر العينات بالكامل في الوسط. يجب ألا تتجاوز المدة بين الاستئصال الجراحي والمعالجة الإضافية للغضروف 24 ساعة. تأكد من أن العينات مغمورة بالكامل في الوسائط طوال عملية المعالجة بأكملها لتجنب تجفيف العينة.
    2. قطع الغضروف بعيدا عن العظام باستخدام مشرط.
  2. توليد القرص الغضروفي
    1. قم بإنشاء أقراص غضروفية بقطر 4 مم باستخدام لكمة خزعة.
      ملاحظة: من المهم تحديد واستئصال مناطق اللقمة حيث يتجاوز سمك طبقة الغضروف 1 مم. قد يكون هذا مشكلة ، خاصة حول المناطق الحاملة ، حيث تفقد طبقة الغضروف عادة سمكها بسبب عمليات البلى أو التنكس.
    2. ضع أقراص الغضروف مقاس 4 مم التي تم إنشاؤها مسبقا على جهاز قطع مصنوع خصيصا وقم بتثبيت أقراص الغضروف وتثبيتها ثابتة عن طريق ملعقة. عند وضع أقراص الغضروف على جهاز القطع ، يجب توخي الحذر. ضع العينات بحيث لا تواجه الطبقة العليا للغضروف (المنطقة السطحية للغضروف المفصلي) الشفرة
    3. قطع أقراص الغضروف بشفرة حلاقة. وبالتالي ، يتم إنشاء عينات غضروفية على شكل قرص من 4 مم × 1 مم. لمنع تجفيف العينة ، قم بإجراء قطع الأنسجة في أسرع وقت ممكن.
    4. اجمع كل قرص بمساعدة ملعقة وضع أقراص الغضاريف المتولدة في أنابيب سعة 1.5 مل تحتوي على 1 مل من DMEM المكمل ب 5٪ (v / v) البنسلين والستربتومايسين. ضع ما يقرب من 15 قرصا في أنبوب واحد.
  3. التقسيم البردي لأقراص الغضاريف (للشرائح العمودية)
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ، ويمكن استخدامها إذا كان من المطلوب تصور الرؤية الجانبية لتوزيع النمط الخلوي داخل أقراص الغضروف. يمكن استخدامه كطريقة للتحقق حيث أن توزيع النمط الخلوي هو ميزة 3D للغضروف المفصلي26. يمكن أيضا استخدام التقسيم البصري وإعادة بناء 3D لأقراص الغضروف بأكملها باستخدام مجهر متحد البؤر ، وبالتالي إزالة الحاجة إلى تقسيم العينات كما هو موضح في البروتوكول.
    1. قم بتغطية قرص الغضروف بوسط تضمين قابل للذوبان في الماء وضعه على حافته على مقبض cryotome (مع سطح القرص عموديا على سطح المقبض). في جهاز cryotome ، يتجمد وسيط التضمين في درجات حرارة منخفضة.
    2. باستخدام cryotome قياسي ، قسم الأنسجة جانبيا بسمك 60 ميكرومتر حتى يتم الوصول إلى منتصف القرص (أي عندما يصل طول عمليات التقطيع بالتبريد إلى 4 مم) وجمع الشرائح. من خلال تقسيم القرص بشكل عمودي ، يمكن تصور جميع مناطق الغضروف (السطحية والمتوسطة والعميقة).
    3. اجمع الأقسام الموجودة على شريحة زجاجية وقم بإزالة وسط التضمين القابل للذوبان في الماء عن طريق الغسيل ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).

2. فرز قرص الغضروف كدالة للنمط المكاني الخلوي

  1. تلطيخ عينات الغضروف على شكل قرص
    1. ضع قرصا غضروفيا واحدا (القسم 1.2) في كل بئر من صفيحة 96 بئرا وأضف 130 ميكرولتر من صبغة مضان نفاذة للخلايا بتخفيف 1: 1000 لكل بئر.
    2. افحص اللوحة بأكملها بصريا وتأكد من وضع قرص واحد فقط في كل بئر. احتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا القياسية عند 37 درجة مئوية.
  2. تلطيخ شرائح الغضروف 60 ميكرومتر
    1. ضع أقسام قرص الغضروف برفق (القسم 1.3) على شرائح المجهر الزجاجي بمساعدة الملقط.
    2. قم بتغطية أقسام الغضروف بوسط تثبيت يحتوي على تلطيخ مضاد ل DAPI النووي وضع برفق أغطية مناسبة للفحص المجهري الفلوري.
    3. أغلق حواف كل غطاء بطلاء أظافر شفاف منتظم واتركه يجف لمدة 3 دقائق.
  3. فرز وتصوير الغضروف من أعلى إلى أسفل ومن الجانب
    ملاحظة: يجب فحص كل قرص تحت مجهر الفلورسنت. الهدف من هذه الخطوة هو فرز الأقراص بناء على نمطها الخلوي السائد (سلاسل مفردة أو سلاسل مزدوجة أو مجموعات صغيرة أو مجموعات كبيرة أو منتشرة).
    1. ضع لوحة 96 بئرا على حامل لوحة المجهر الفلوري.
    2. حدد مرشح التألق المناسب إما Em 495 nm / Ex 515 nm (للتصوير من أعلى إلى أسفل لأقراص الغضاريف المعدة في القسم 2.1.) أو Em 358 nm / Ex 461 nm (للتصوير الجانبي لأقسام الغضروف المعدة في القسم 2.2) والهدف 10x.
      ملاحظة: يسمح استخدام الهدف 10x بفحص محيط القرص بالكامل ، ويمكن استبعاد العينات ذات التلوين غير المتجانس أو غير المناسب. ومع ذلك ، فإن استخدام العرض من أعلى إلى أسفل فقط قد يؤدي إلى إدراك التغيرات في التنظيم الخلوي نتيجة لتحليل طبقات الأنسجة العميقة التي أصبحت مرئية للمراقبة من أعلى إلى أسفل عن طريق التآكل السطحي. على سبيل المثال ، يمكن اعتبار الخيط الصاعد الذي يتبع أروقة الكولاجين على أنه خلية واحدة أو خلايا مبعثرة (نمط منتشر)26. نتيجة لذلك ، يجب فحص جانبي الأقراص لضمان اختيار النمط الخلوي المناسب.
    3. حدد بصريا النمط الخلوي المعروض في كل قرص غضروف. من غير المحتمل أن يحتوي القرص على نوع واحد فقط من الأنماط الخلوية. بالنسبة لجزء القرص الذي لا يتطابق فيه ترتيب الخلايا الغضروفية مع نمط الاهتمام ، اقبل العينات فقط إذا كان النمط غير المرغوب فيه في المحيط ، حيث لا يتم إجراء قياسات AFM (أي ما يصل إلى 0.5 مم من حدود القرص) ، وتأكد من أن هذا لا يتجاوز 10٪ من إجمالي سطح القرص27 ، 28.
  4. الحصول على صورة لأقراص الغضروف بأكملها
    1. حدد الهدف 10x من المجهر وضعه أسفل البئر المحدد مسبقا الذي يحتوي على قرص غضروفي فردي. ركز على القرص لرؤية النمط الخلوي.
    2. حدد وظيفة المستكشف للحصول على نظرة عامة على البئر بالكامل. استخدم زر الماوس الأيسر واسحب للانتقال إلى موضع مرحلة مختلف. باستخدام عجلة الماوس ، قم بالتكبير والتصغير.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن رؤية معاينة البئر مع العينة بأكملها بالنقر المزدوج على كل منطقة اهتمام بالتتابع.
    3. حدد مربعا يشمل منطقة الاهتمام المراد مسحها ضوئيا ؛ في هذه المرحلة ، ستصبح جميع البلاطات الفردية التي تتكون منها الفسيفساء مرئية.
    4. اضبط شدة التعرض / الضوء بحيث يمكن رؤية الخلايا بوضوح من الخلفية. في هذه المرحلة ، تم ضبط سطوع / تباين الصورة لجميع المربعات ولم يعد من الممكن تخصيصها بشكل فردي لكل بلاطة.
      ملاحظة: نظرا لأن الخلايا القريبة من حافة القرص غالبا ما تصدر إشارة مضان أعلى من الخلايا الموجودة في المركز ، يجب تكييف إعدادات التعرض / شدة الضوء.
      1. لتقييم ما إذا كان وقت التعرض مناسبا لقناة معينة ، افحص توزيع الإشارة في الرسم البياني. باستخدام آلية التعرض التلقائي المضمنة في برنامج صورة المجهر ، تصور جميع الخلايا الموجودة داخل القرص.
    5. حدد خيار Focus Map Point الخاص بالبرنامج ، ثم حدد كل بلاطة فردية بالنقر بزر الماوس الأيسر في وسطها.
    6. حدد الخيار خريطة التركيز. يتم عرض نافذة مع جميع التجانبات المحددة مسبقا. انقر نقرا مزدوجا فوق مربع في القائمة لعرضه ووضعه في التركيز المناسب.
    7. انقر فوق تعيين Z لحفظ الخطة البؤرية والمتابعة إلى اللوحة التالية. بعد ضبط الخطة البؤرية لكل لوحة على حدة، ابدأ الحصول على الصور بالضغط على Start Scan.
      1. إذا كان المسح الضوئي يعرض أشرطة أفقية و/أو رأسية أغمق، فقد يرجع ذلك إلى الإضاءة غير الصحيحة وغير المتساوية للإطارات المفردة. حل هذه المشكلة باستخدام خيار التظليل المرتبط المدمج في البرنامج قبل الفحص الفعلي.
    8. حفظ الصور وتصديرها وإضافة تعليقات توضيحية إليها بشكل صحيح.

3. النهج الميكانيكي الحيوي لنباتات الغضاريف

  1. تحضير العينة لقياسات AFM
    1. ثبت كل قرص غضروفي محدد مسبقا يحتوي على نمط خلوي (القسم 2) في أطباق بتري عن طريق غراء متوافق حيويا. أضف عينة كافية من الغراء على الجوانب العلوية والسفلية واليسرى واليمنى من القرص.
    2. قم بتغطية الأقراص ب 2.5 مل من وسط L-15 من Leibovitz بدون L-glutamine. أضف وسط Leibowitz برفق إلى العينات لتجنب انفصال العينة عن السطح بسبب الموجات الناتجة عن الوسط.
  2. تحميل العينات في AFM
    1. ضع طبق بتري في حامل عينة جهاز AFM وقم بتشغيل سخان أطباق بتري مضبوطا على 37 درجة مئوية. اسمح لطبق زراعة الأنسجة بالوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة. يتم ذلك لاستبعاد القطع الأثرية المحتملة الناجمة عن اختلاف درجة الحرارة.
  3. معايرة ناتئ AFM
    1. قم بتهيئة إعداد البرنامج كما هو موضح سابقا بواسطة Danalache et al.29.
    2. حدد حامل ناتئ زجاجي مناسب لقياسات السائل وضعه بعناية على رأس AFM. تعمل آلية القفل على تأمين الكتلة الزجاجية في رأس AFM. تأكد من أن السطح العاكس للكتلة الزجاجية مستقيم ومتوازي مع حامل AFM.
    3. ضع الكابولي على سطح حامل الكابولي الزجاجي بعناية. يجب أن يرتكز الكابولي نفسه على المستوى البصري المصقول ، في وسط الكتلة الزجاجية.
    4. ضع بعناية تنورة سيليكون (غشاء سيليكون) على قاعدة حامل الكابولي لمنع التكثيف المتوسط في رأس AFM.
    5. اخفض الكابولي بخطوات 100 ميكرومتر باستخدام وظيفة محرك السائر حتى يتم غمره بالكامل في الوسط.
    6. قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي باستخدام معلمات النهج التي وصفها Danalache et al.29. اسحب الكابولي بمقدار 100 ميكرومتر بمجرد الوصول إلى قاع طبق بتري.
    7. قم بمعايرة الكابولي باستخدام الخطوات الدقيقة وقم بتشغيل المعلمات التي وصفها Danalache et al.29. في نهاية المعايرة ، يتم حفظ الانحراف الرأسي وعرضه بوحدات نيوتن (N) للقوة بدلا من فولت (V) - وحدة التسجيل الأصلي بواسطة كاشف الصمام الثنائي الضوئي. في التجارب هنا ، نتجت نقطة ضبط 4.47 nN بعد المعايرة.
    8. باستخدام وظيفة محرك السائر ، اسحب الكابولي إلى 1000 ميكرومتر.
  4. تحديد موقع قياس الغضروف المطلوب تحت AFM
    ملاحظة: نظرا لسمك أقراص الغضروف 1 مم ، فإن الكابولي غير مرئي في مجال الرؤية أثناء التنقل فوق العينة.
    1. استخدم كاميرا CCD للمجهر لتحديد الكابولي. يجب وضع ناتئ AFM في منطقة خالية من العينات من طبق بتري.
    2. ابدأ نهج الماسح الضوئي باستخدام الكابولي على منطقة نظيفة وخالية من العينات من طبق بتري ، باستخدام نفس المعلمات التي وصفها Danalache et al.29.
    3. مزيد من سحب الكابولي 1.5 مم بعيدا عن الجزء السفلي من اللوحة مع التحكم في محرك السائر. هذه الخطوة حاسمة لتجنب التصادم المباشر بين الكابولي والعينة.
    4. قم بالتبديل من عرض برايتفيلد إلى عرض مضان وحدد الجزء العلوي من القرص بصريا.
    5. حرك حامل عينة AFM بالضبط 2 مم باتجاه منتصف القرص. تعتبر هذه النقطة مركز القرص الغضروفي.
    6. قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي ، وبمجرد الوصول إلى سطح قرص الغضروف ، اسحب الكابولي بمقدار 100 ميكرومتر.
  5. قياسات منحنى مسافة القوة
    1. ركز على الخلايا الموضوعة في موقع القياس المطلوب. انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء القياسات وتوليد منحنيات مسافة القوة في الموضع المستهدف.
    2. احصل على خمسة منحنيات لمسافة القوة في كل موقع قياس. اسحب الكابولي بمقدار 500 ميكرومتر وانقل الكابولي إلى موقع القياس التالي.
      ملاحظة: يعد تراجع الكابولي خطوة حاسمة ، لأن سطح قرص الغضروف غير متجانس وبه مخالفات. يمكن أن يؤدي التل المرتفع على سطح العينة إلى تصادم دراماتيكي ، مما يؤدي إلى تلف طرف ناتئ / عينة غير مرغوب فيه. نوصي باختيار ما لا يقل عن خمسة مواقع قياس مختلفة منتشرة عبر سطح القرص والحصول على ما لا يقل عن خمسة منحنيات لمسافة القوة في كل موقع.
    3. افحص منحنيات مسافة القوة واحفظها.
  6. تقدير وحدات يونغ باستخدام نموذج هيرتز فيت
    1. افتح منحنيات مسافة القوة التي تم إنشاؤها ليتم تحليلها (ملف .jpk) في برنامج تحليل البيانات باستخدام خيار فتح مجموعة من منحنيات التحليل الطيفي .
    2. حدد نموذج ملاءمة هرتز ثم حدد خيار ملاءمة المرونة .
      1. يقوم خيار ملاءمة المرونة تلقائيا بإجراء الحسابات التالية على منحنى مسافة القوة المحدد: يحسب خط الأساس ويطرح من المنحنى بأكمله لإزالة إزاحة خط الأساس (يتم إرجاع خط الأساس إلى الصفر على المحور ص) ؛ يحدد نقطة الاتصال عن طريق اكتشاف النقطة التي يعبر فيها منحنى مسافة القوة خط القوة الصفرية (يتم ضبط نقطة الاتصال على الصفر على المحور السيني) ؛ يحسب فصل عينة الطرف (يتم طرح إشارة ارتفاع بيزو التي تمثل ثني الكابولي) ؛ ويناسب منحنى مسافة القوة تلقائيا مع الطراز المحدد. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أيضا تنفيذ كل خطوة من هذه الخطوات بشكل مستقل.
    3. التكيف باستخدام معلمات الملاءمة التالية: نسبة بواسون 0.5 ونصف قطر طرف الكابولي المناسب.
      ملاحظة: عند استخدام ناتئ بطرف ناتئ كروي ، يجب استخدام نموذج Hertz fit. كان للناتئ المستخدم في هذه الدراسة طرف كروي نصف قطره 5 ميكرومتر. نوصي بتركيب منحنى مسافة القوة حتى يتم الوصول إلى أقصى قوة مطبقة (نقطة الضبط).
    4. تحقق بصريا من ملاءمة منحنى مسافة القوة لضمان صحتها. يجب القيام بهذه الخطوة لكل من منحنيات مسافة القوة التي تم تحليلها.
  7. تحديد عمق المسافة البادئة
    ملاحظة: اعتمادا على أداة تحليل البيانات المستخدمة، قد تختلف هذه العملية. يمكن للمجرب قراءة عمق المسافة البادئة بسهولة باتباع سلسلة من الخطوات المضمنة في برنامج تحليل البيانات.
    1. افتح كل من منحنيات مسافة القوة التي تم إنشاؤها في برنامج تحليل البيانات وحدد نموذج Hertz fit كعملية تحليل.
    2. قم بتطبيق خيار طرح إزاحة الخط الأساسي لتصفير محور الانحراف الرأسي (المحور ص) وحدد دالة الإزاحة + الإمالة .
    3. استخدم وظيفة البحث عن نقطة اتصال لتحديد نقطة الاتصال تلقائيا ، والتي يتم إحداثها تلقائيا إلى إحداثي x يساوي صفرا.
    4. اطرح المسافة التي تمثل فقط انحراف الكابولي من ارتفاع بيزو الخام أثناء المسافة البادئة باستخدام وظيفة موضع الطرف الرأسي .
    5. حدد خيار ملاءمة المرونة لعرض منحنى مسافة القوة المعالجة وحدد مساحة الرسم البياني بحيث تصطف مع القيمة الأكثر سالبة على محور موضع الطرف الرأسي (المحور x).
    6. اقرأ المسافة البادئة وقم بتوثيقها من مربع X Min في علامة تبويب المعلمة. احفظ النتائج وقم بتوثيقها.

4. التحليل الإحصائي

  1. افتح البرنامج الإحصائي. حدد مجموعة بيانات جديدة من القائمة المنسدلة.
  2. افتح علامة التبويب طريقة عرض المتغيرات بعد تحديد ملف DataSet . حدد المتغيرات العددية لكل فئة نمط خلوي: سلاسل مفردة = SS ، سلاسل مزدوجة = DS ، مجموعات صغيرة = SC ، مجموعات كبيرة = BC ، منتشرة ووحدات يونغ.
  3. في علامة تبويب عرض البيانات ، أدخل بيانات وحدات Young المقاسة لكل فئة من فئات الأنماط الخلوية المقابلة. قم بتحليل توزيع البيانات عن طريق تحديد تحليل من شريط القوائم، ثم تحليل البيانات الاستكشافية.
  4. حدد وحدات يونغ كمتغير تابع والنمط الخلوي كقائمة عوامل. يتم عرض مخطط مربع مستخدم لقسم النتائج بين النتائج في ملف الإخراج.
  5. لإجراء تحليل إحصائي، اختر نماذج تابعة في قسم الاختبار اللامعلمي من علامة تبويب شريط قائمة التحليل. حدد وحدات يونغ كحقول اختبار ونمط خلوي كمجموعات ضمن علامة التبويب الحقول. اضغط على تشغيل.
    ملاحظة: يتم عرض النتائج في ملف الإخراج. للتحليل الإحصائي ، يتم إجراء اختبار فريدمان.
  6. قم بدمج القيم p للاختبار اللامعلمي في مخطط المربع الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.4. احفظ النتائج بالنقر فوق ملف في شريط القائمة وتحديد حفظ.

النتائج

باستخدام جهاز قطع عصامي ، تمكنا من زرع وتوليد أقراص غضروفية صغيرة (4 مم × 1 مم) من لقمات بشرية جديدة تحتوي على نمط مكاني خلوي واحد30 من سلاسل مفردة (SS ، الشكل 2A) ، سلاسل مزدوجة (DS) ، مجموعات صغيرة (SC) ، مجموعات كبيرة (BC ؛ الشكل 2 أ) ، ومنتشر (ا?...

Discussion

كمرض تدريجي ومتعدد العوامل ، يؤدي OA إلى تغييرات هيكلية ووظيفية في الغضروف المفصلي. طوال فترة الزراعة العضوية ، يصاحب ضعف الخواص الميكانيكية تغيرات هيكلية وكيميائية حيوية على سطح الغضروف المفصلي27,31. الأحداث المرضية المبكرة التي تحدث في الزراعة العضوية هي ن...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر جراحي العظام من قسم جراحة العظام في مستشفى جامعة توبنغن على تقديم عينات الأنسجة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BMerck KGaA, Darmstadt, Germany1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyJPK00518
Biocompatible sample glue Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyH000033
Calcein AMCayman, Ann Arbor, Michigan, USA14948Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
CantileverBruker Nano GmbH, Berlin, GermanySAA-SPH-5UMFrequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device Self-made n/aCutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFMThe Imaging Source Europe GmbH, Bremen, GermanyDFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscopeLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyCM3050S 
Data Processing Software for the AFMBruker Nano GmbH, Berlin, Germanyn/aVersion 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Germany11889113
Glass block cantiliver holderBruker Nano GmbH, Berlin, GermanySP-90-05Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF1315
Microscope glass slidesSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USACLS294775X50
Mounting medium With DAPIibidi GmbH, Gräfelfing, Germany50011Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyT-05-0117
ScalpelFeather Medical Products, Osaka, Japan2023-01
Silicone SkirtBruker Nano GmbH, Berlin, Germanyn/aProtective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSSIBM, Armonk, New York, USASPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, NetherlandsSA6255012Water-soluble embedding medium 

References

  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K., Santos, N. C., Carvalho, F. A. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. , 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A., Olson, S. A., Gauilak, F. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. , 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -. C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G., Subic, A. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). , 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -. E., Lin, K. -. H., Juang, J. -. Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. . The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

188

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved