Комплексный анализ прокоагулянтных тромбоцитов, проявляющих признаки некроза, апоптоза и активации тромбоцитов

Наши исследования сосредоточены на понимании метаболизма тромбоцитов и передачи сигналов во время протромботических состояний, таких как антифосфолипидный синдром и рак, с целью выявления новых биомаркеров и терапевтических мишеней. Наша группа была в авангарде недавнего всплеска интереса к тому, как метаболизм тромбоцитов способствует активации тромбоцитов и тромбозу. Точная характеристика состояния активации тромбоцитов в кровотоке у пациентов для определения риска тромбоза, а также терапевтической эффективности антиагрегантов остается серьезной проблемой.

Аэробный гликолиз, пентозофосфатный путь и бета-окисление жирных кислот были раскрыты как отличительные пути энергетического метаболизма в тромбоцитах, и их потенциал был установлен для терапевтического таргетирования. Этот протокол помогает в идентификации и точной функциональной характеристике прокоагулянтных тромбоцитов, отличных от проагрегаторных тромбоцитов, а также тромбоцитов, подвергающихся гибели клеток в результате апоптоза или некроза. Для начала дополните промытые человеческие тромбоциты 2,5 миллимолярами кальция, добавив 0,5 микролитра 0,5 молярного раствора хлорида кальция на 100 микролитров взвеси тромбоцитов.

Держите одну фракцию тромбоцитов нестимулированной и стимулируйте оставшуюся фракцию комбинацией тромбина и судорог в течение 15 минут при комнатной температуре. После стимуляции добавьте по одному микролитру аннексина V, одного пакета и антитела против CD62P к 100 микролитрам стимулированных тромбоцитарных суспензий. Инкубируйте тромбоциты в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Через 30 минут зафиксируйте тромбоциты, добавив равный объем 2% формалина, прежде чем анализировать образцы с помощью проточной цитометрии для количественного определения прокоагулянтных тромбоцитов. Для приготовления тромбоцитов разведите промытые человеческие тромбоциты до концентрации один миллион тромбоцитов на миллилитр и дополните 2,5 миллимолярами кальция. Пометьте тромбоциты пятью микромолярами ROD2 для обнаружения митохондриального кальция и инкубируйте в течение 30 минут в темноте.

Для приготовления тромбоцитов для анализа активации каспаз, после добавления в тромбоциты кальция и стимуляции фракции, добавляют к стимулированным тромбоцитарным суспензиям активный кристалл для мечения каспаз. Инкубируйте тромбоциты в течение 30 минут в темноте. Через 30 минут зафиксируйте тромбоциты, добавив равный объем 2% формалина, прежде чем анализировать тромбоциты с помощью проточной цитометрии.

Результаты показывают, что тромбин индуцировал дозозависимое увеличение доли тромбоцитов, экспрессирующих как фосфатидилсерин, так и Р-селектин. Стимуляция тромбином также вызывала зависящее от времени повышение уровня митохондриального кальция в тромбоцитах. Однако стимуляция тромбином привела к снижению потенциала митохондриальной мембраны в тромбоцитах.

Стимуляция тромбином активировала каспазу-8, но не каспазу-3 или 7 в тромбоцитах.