Основной задачей нашей лаборатории является определение механизмов регенерации центральной нервной системы млекопитающих с помощью модельного организма C.elegans. Мы изучаем регенерацию нескольких нейронов и ищем идентичность сигнала прекондиционирования, который приводит к усиленной регенерации центральной нервной системы. Текущие экспериментальные задачи включают в себя введение пузырьков воздуха при замене стеклянной пластины на виниловой пластинке и получение равномерной толщины пресс-формы.
Однако, как только форма PDMS создана, ее можно повторно использовать для губок. Пробел в исследованиях, который мы устраняем, заключается в ограниченном контроле над ориентацией взрослых животных. Взрослые животные больше в диаметре и более пигментированы, что создает проблемы для визуализации в более глубоких плоскостях Z.
Кроме того, введение покровного стекла также изменяет первоначальную ориентацию. Каналы помогают поддерживать ориентацию животных при введении покровного стекла, позволяя клеткам-мишеням быть ближе к объекту визуализации. Каналы также снижают нагрузку на животных, способствуя нормальной физиологии, стимулируя линейную конфигурацию животных и создавая согласованность при визуализации нескольких животных.
Для начала налейте в одноразовую весовую чашу соотношение один к 10 быстроотверждаемого средства к основанию. Тщательно перемешивайте незавержденную жидкость в течение 45 секунд, пока она полностью не смешается и не наполнится пузырьками. Затем поместите лоток с неотвержденной смесью PDMS в вакуумный эксикатор под наклоном.
Трижды переставьте давление в диапазоне от минус 0,09 килопаскаль до минус 0,1 килопаскаль, чтобы пузырьки воздуха вышли на поверхность. Тщательно промойте виниловую пластинку и стеклянную пластину деионизированной водой и дайте виниловой пластинке полностью высохнуть на воздухе перед дальнейшим использованием. Положите лист алюминиевой фольги поверх горячей плиты, чтобы собрать излишки PDMS.
Затем поместите предметное стекло на каждый конец виниловой пластинки, чтобы установить толщину формы, обеспечивая равномерную высоту при нажатии стекла на неотвержденный PDMS. Теперь вылейте неотвержденную жидкость PDMS на одну сторону виниловой пластинки. Наклоните стеклянную пластину и медленно опустите ее, чтобы воздух мог выйти.
Затем высушите PDMS при температуре 100 градусов Цельсия в течение 20 минут. Снимите виниловую пластинку с горячей плиты и дайте ей остыть. После этого аккуратно отклейте PDMS от виниловой пластинки, чтобы избежать разрывов.
Затем снимите PDMS со стекла. Используя новое предметное стекло в качестве ориентира, разрежьте PDMS острой бритвой, чтобы получилась форма с каналами из агара. Очистите от излишков PDMS, чтобы показать окончательный срез канальной формы для агара.
Добавьте в колбу 0,6 грамма агара и 30 миллилитров жидкого запаса среды для роста нематоды. Поместите в колбу мешалку и нагрейте смесь на горячей плите, установив ее до 120 градусов Цельсия. Добавьте 120 микролитров стокового раствора азида натрия после того, как гель расплавится.
Затем тщательно промойте форму PDMS водой и дайте ей высохнуть на воздухе. Поместите форму PDMS между двумя наборами пар слайдов, чтобы подготовить ее к использованию. С помощью пипетки набирайте раствор агара вверх и вниз, чтобы нагреть наконечник пипетки, и нанесите 300 микролитров расплавленного агара на форму PDMS.
Наконец, поместите предметное стекло микроскопа прямо на агар, убедившись, что оно опирается на предметные стекла по бокам. Снимите предметное стекло после того, как агар полностью остынет. Канальные агаровые подушечки облегчали точную ориентацию Caenorhabditis elegans, переворачивая животное для выравнивания ориентиров, таких как вульва и S-образная кишка, проверенных под флуоресцентным препарирующим микроскопом перед переносом в инвертированный микроскоп.
Флуоресцентная визуализация подтвердила правильную ориентацию Caenorhabditis elegans на канальных агаровых подушечках, как показано на флуоресцентных микрофотографиях. Канальные агаровые прокладки улучшили качество визуализации для регенерации нейронов за счет расположения регенерированных нейронных волокон ближе к линзе объектива, сводя к минимуму рассеяние и поглощение света.
