通道琼脂垫上秀 丽隐杆 线虫方向的微调用于神经再生成像

我们实验室的主要重点是使用模式生物秀丽隐杆线虫定义哺乳动物中枢神经系统再生的机制。我们研究多个神经元的再生，并寻求导致增强中枢神经系统再生的预处理信号的身份。目前的实验挑战包括在更换黑胶唱片上的玻璃板时引入气泡，并获得均匀的模具厚度。

但是，一旦创建了 PDMS 模具，它就可以重新用于钳口。我们正在解决的研究差距是对成年动物方向的有限控制。成年动物的直径更大，色素沉着更多，导致在更深的 Z 平面上成像问题。

此外，盖玻片的引入也会改变初始方向。这些通道有助于在引入盖玻片时保持动物的方向，使靶细胞更接近成像目标。这些通道还可以减轻动物的压力，促进正常的生理机能，鼓励线性动物配置，并在跨多个动物成像时创建一致性。

首先，将 1 比 10 的快速固化剂与基底的比例倒入一次性称重盘中。将未固化的液体充分混合 45 秒，直到它完全融合并充满气泡。然后将装有未固化 PDMS 混合物的托盘倾斜放入真空干燥器中。

在负 0.09 千克帕斯卡和负 0.1 千克帕斯卡之间循环压力 3 次，以使气泡浮出水面。用去离子水彻底冲洗黑胶唱片和玻璃板，让黑胶唱片完全风干后再进一步使用。在热板顶部放置一张铝箔以接住任何多余的 PDMS。

然后在乙烯基唱片的每一端放置一个载玻片以设置模具厚度，确保在将玻璃板压到未固化的 PDMS 上时高度一致。现在，将未固化的 PDMS 液体倒在黑胶唱片的一侧。倾斜玻璃板并慢慢将其放下，以使滞留的空气逸出。

然后在 100 摄氏度下固化 PDMS 20 分钟。从热板中取出黑胶唱片并使其冷却。之后，小心地从黑胶唱片上撕下 PDMS 以避免撕裂。

然后从玻璃板上剥离 PDMS。使用新的载玻片作为导向，用锋利的剃刀切割 PDMS，以创建通道状琼脂模具。剥去多余的 PDMS 以显示最终切割的通道琼脂模具。

将 0.6 克琼脂和 30 毫升线虫生长培养基液体原液加入培养瓶中。将搅拌棒放入烧瓶中，在热板上加热混合物，温度设置为 120 摄氏度。凝胶熔化后加入 120 μL 叠氮化钠储备液。

然后用水彻底清洗 PDMS 模具并风干。将 PDMS 模具放在两组滑块对之间以准备使用。使用移液管上下抽动琼脂溶液以加热移液器吸头，然后将 300 微升熔化的琼脂移液到 PDMS 模具上。

最后，将显微镜载玻片直接放在琼脂上，确保它放在侧面的载玻片上。琼脂完全冷却后取出载玻片。通道状琼脂垫通过滚动动物以对齐标志（例如外阴和 S 形肠）来促进秀丽隐杆线虫的精确定位，在转移到倒置显微镜之前在荧光解剖显微镜下进行验证。

荧光成像验证了秀丽隐杆线虫在通道状琼脂垫上的正确方向，如荧光显微照片所示。通道式琼脂垫通过将再生的神经元纤维定位在更靠近物镜的位置，最大限度地减少光散射和吸收，从而提高了神经元再生的成像质量。