Наши исследования сосредоточены на прогрессирующих нейродегенеративных заболеваниях, характеризующихся накоплением ядерного белка TDP-43 в цитоплазме, таких как БАС или FTLD-TDP. Мы стремимся понять, как патологии TDP-43 распространяются по мозгу прионоподобным образом. Ранее мы обнаружили, что высвобождение TDP-43 через внеклеточные везикулы опосредовано нарушением регуляции аутофагии.
Програнулин FTLD-TDP облегчает этот процесс. Следующая задача состоит в том, чтобы выяснить, как аутофагия регулирует производство и высвобождение внеклеточных везикул, содержащих TDP-43, что может привести к открытию терапевтических мишеней для БАС или FTLD-TDP. Для начала возьмите культивируемые клетки HeLa, подсчитайте их с помощью клеточного счетчика и засейте один умножить на десять в степени шести клеток на шестисантиметровой пластине, содержащей питательную среду.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и контролируемой влажностью в течение 24 часов. Далее приготовьте 20-микролярный раствор миРНК. Смешайте 100 микролитров восстановленной сывороточной среды и три микролитра миРНК в пробирке с низким удерживающим веществом для приготовления раствора А. Затем смешайте 100 микролитров восстановленной сывороточной среды и пять микролитров реагента для трансфекции в пробирке с низким удерживающим веществом для приготовления раствора В. После этого смешайте раствор А и раствор В, затем инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение пяти минут.
Теперь добавьте смесь растворов А и В в среду, используемую для культивирования клеток HeLa, и инкубируйте в течение 24 часов. На следующий день промойте клетки PBS и подвергните клетки воздействию 500 микролитров 0,25% трипсина и одного миллимолярного раствора ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и контролируемой влажностью в течение пяти минут. Далее добавьте в клетки 2,5 миллилитров питательной среды и с помощью переводной пипетки Пастера с прикрепленным наконечником пипетки объемом 20 микролитров приготовьте одноклеточную суспензию.
После подсчета ячеек сеять один умножить на десять в степени шести клеток на десятисантиметровую пластину и инкубировать, как было продемонстрировано ранее. В конце инкубации готовят питательную среду, содержащую либо носитель, либо 100 наномолярного бафиломицина А1. Затем подвергают клетки воздействию среды, содержащей либо носитель, либо 100 наномолярный бафиломицин А1, и инкубируют в течение 24 часов. На следующий день соберите всю питательную среду с 10-сантиметровой пластины.
Переложите собранную среду в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте ее при 3000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Чтобы выделить фракцию внеклеточного везикулы Р1, перенесите надосадочную жидкость после центрифугирования при 3000 G в центрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирку при температуре 20 000 G при четырех градусах Цельсия в течение одного часа.
Для выделения фракции внеклеточных везикул P2 перенесите надосадочную жидкость после центрифугирования при 20 000 G в ультрацентрифужную пробирку. Центрифугируйте его при 110 000 G при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. После вытирания лишней влаги внутри пробирки лабораторной салфеткой ресуспендируйте оставшиеся гранулы в центрифужной пробирке в 50 микролитрах двукратного буфера для проб для приготовления фракции внеклеточных везикул Р1.
Затем удалите надосадочную жидкость путем декантации. Сотрите лишнюю влагу внутри пробирки с помощью лабораторной салфетки и повторно суспендируйте оставшиеся гранулы в ультрацентрифугирующей пробирке в 50 микролитрах двукратного буфера для проб для приготовления фракции внеклеточных везикул Р2. Инкубируйте фракции внеклеточных везикул P1 и P2 при температуре 100 градусов Цельсия на тепловом блоке в течение 10 минут.
Переложив питательную среду из 10-сантиметровой тарелки в 15-миллилитровую пробирку, промойте клетки в 10-сантиметровой посуде PBS. Затем подвергните клетки воздействию двух миллилитров 0,25% трипсина и одного миллимолярного раствора ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и контролируемой влажностью в течение пяти минут. Добавьте в клетки восемь миллилитров питательной среды.
С помощью переводной пипетки Пастера с прикрепленным наконечником для пипетки объемом 200 микролитров нанесите пипетку на клетки, чтобы получить одноклеточную суспензию. Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте ее при 1000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора.
Добавьте PBS в клеточную таблетку и центрифугируйте при 1000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления PBS обработайте клеточную гранулу ультразвуком в одном миллилитре буфера A68, содержащего 1% саркозила. Смешайте 300 микролитров клеточного лизата со 100 микролитрами четырехкратного буфера для пробы.
Инкубируйте смесь при температуре 100 градусов Цельсия на термоблоке в течение 10 минут для приготовления клеточной фракции.
