Этот метод может помочь нам решить ключевые вопросы, касающиеся роли внеклеточных пузырьков in vivo, предоставляя нам источник пузырьков, которые являются репрезентативными для микроокноронности местных тканей. Исследования внеклеточных пузырьков в среде тканей могут еще больше помочь нашему пониманию физиологических ролей внеклеточных пузырьков и их изменений в патофизиологических процессах in vivo. Визуальная демонстрация канюляции вены портала полезна, так как небольшой размер вены затрудняет поворот манипуляции.
Демонстрацией процедуры с доктором Каори Исигуро будет Ирен Ян, научный технолог из моей лаборатории. Перед началом процедуры закрепните конечности обезболивающей мыши и соедините 23-го калибра иглы крылатого сбора крови к свободному концу трубки шприц-насоса. Очистите брюшную кожу мыши 70%этанолом и спиртовой прокладкой и используйте ножницы, чтобы открыть мышь от передней части грудной клетки до тазовой кости, заботясь о том, чтобы не повредить внутренние органы.
Используйте хлопчатобумажный наконечником аппликатора, чтобы аккуратно переместить кишечник в правую сторону брюшной полости, чтобы разоблачить портал вены и нижней вены кавы и использовать изогнутые типсы, чтобы поместить нить под портал вены. Свяжите узел свободно в шве для того чтобы подготовить для cinching после cannulation и заполнить cannula с 40 градусами Celsius HBSS до тех пор пока разрешение не достигнуть кончик иглы cannula. Вставьте канюлю в вену портала на 5-10 миллиметров ниже лигатуры и закрести канюлю швом.
Начните настой со скоростью от одного до двух миллилитров в минуту. Если канюла была правильно помещена, печень начнет бланшировать. Вырезать нижней вены кавы и позволяют чрезмерной жидкости в печени для слива.
Медленно увеличить скорость потока до восьми миллилитров в минуту, пока полный 50 миллилитров HBSS был проникнут через печень в течение следующих пяти минут. Незадолго до HBSS иссякнут, изменить свежеприготовленные 40 градусов по Цельсию коллагеназы четыре раствора перфуза стакан и использовать щипцы применять переходное давление на нижняя кава вены на пять секунд интервалы, чтобы вызвать печень набухают и помочь с пищеварением тканей и диссоциации. Как пищеварение прогрессирует, печень будет набухать и стать белым.
Когда остается депрессии после нежного зондирования с хлопчатобумажной наконечником аппликатора, остановить насос и удалить канюлю. Удалить желчный пузырь из печени, будьте осторожны, чтобы не разорвать желчного пузыря ткани, и использовать чистые ножницы и миппы для сбора печени в стерильные 10 сантиметров культуры блюдо PBS. После мягкого мытья, передать печень в новый 10 сантиметров культуры блюдо, содержащее свежий коллагеназы четыре раствора и использовать два чистых типса, чтобы разорвать печень в то время как мягко тряски, чтобы отмежевать клетки от ткани печени.
Когда весь орган был фрагментирован, используйте три миллилитровый шприц, чтобы тритурировать навоз ткани до тех пор, пока непереваренные кусочки печени не будут стряхнуты. Налейте полученный раствор клетки через 70 микрон нейлоновой сетки ситечко в 50 миллилитров конической трубки, мыть блюдо с HBSS для сбора любых оставшихся клеток. Бассейн мыть с одноклеточной подвески и удалить гепатоциты центрифугации.
Затем перенесите супернатант в новую 50-миллилитровую трубку. Чтобы удалить любые другие клетки, центрифуга supernatant перед передачей в новую 50 миллилитров конической трубки. Удалите мертвые клетки с другой центрифугации и передать supernatant в круглую нижнюю трубку, чтобы удалить любые ячейки мусора и агрегатов.
Теперь перенесите супернатант в поликарбонатную ультрацентрифугу и повторно посовелите гранулы примерно в 20 миллилитров PBS для второй и последней ультра центрифугации. Затем повторно расходуйте внеклеточные гранулы нановерзикулы в один миллилитр PBS при температуре минус 80 градусов по Цельсию, если пузырьки не будут немедленно проанализированы. Из одной печени мыши, этот метод дает ткани внеклеточной концентрации пузырьков, которая колеблется от 1,74 до четырех раз 10 до двенадцатого со средним 3,46 раза 10 до двенадцатой частицы на миллилитр, как это определено анализом слежения за наночастицами.
Средний размер изолированных внеклеточных пузырьков ткани печени составляет 157,7 нанометров с размером режима 144,5 нанометров и внеклеточных размеров пузырьков в диапазоне от 100 до 600 нанометров с помощью анализа слежения за наночастицами. Внеклеточные пузырьки, изолированные с помощью этого подхода, подходят для применения ниже по течению, и дальнейшая характеристика может включать морфологические оценки с помощью электромикроскопии или анализа их поверхностных маркеров или содержания.
