Наша группа использует EPG для изучения того, как арбовирусы и другие факторы влияют на поведение зонда и проглатывания, которое происходит во время кормления кровью, поскольку многие патогены манипулируют поведением переносчиков для усиления передачи. По сути, мы изучаем, что происходит во время укуса комара и как это поведение влияет на передачу патогенов и патологию заболеваний. Исторически сложилось так, что EPG преимущественно использовался для изучения насекомых, питающихся растениями.
Недавняя разработка процедур AC-DC EPG для членистоногих, питающихся кровью, позволяет нам изучать поведение зондирования и проглатывания, которое происходит во время кормления кровью, в беспрецедентных деталях без необходимости инвазивных процедур, что, возможно, позволяет разработать новые стратегии лечения. Самая большая проблема использования EPG на членистоногих, питающихся кровью, заключается в корреляции форм волн с биологическими активностями, такими как слюноотделение и передача патогенов. У нас есть сильные гипотезы, основанные на электрическом происхождении волн и литературе, но нам все еще нужны эмпирические доказательства.
Для начала пропустите кончик стеклянной пипетки через пламя, слегка вращая пипетку. Осмотрите диаметр и повторите процесс, чтобы довести пипетку до нужного размера. Чтобы сделать аспиратор от насекомых, накройте большой конец модифицированной пастбищной пипетки москитной сеткой и вставьте в нее силиконовую трубку, подключенную к лабораторному аспиратору, закрепив место соединения изолентой.
Для регистрирующих электродов оберните пенопластовый блок свежей полиэтиленовой пленкой для хранения подготовленных огрызков насекомых и проводных комаров. Соскребите верхний один сантиметр медной проволоки лезвием бритвы до блеска со всех сторон. Затем разрежьте золотую проволоку диаметром 0,025 миллиметра на куски длиной четыре-пять сантиметров.
Держите проволоку в самозакрывающихся щипцах, замаскированных скотчем, чтобы избежать вмятины на проволоке, аккуратно оберните золотую проволоку три раза вокруг медной проволоки от насекомых, начиная с чистого кончика медной проволоки. С помощью рассекающего щупа нанесите серебряный клей, чтобы удержать золотую проволоку на месте. Убедившись, что нет свободного конца, поместите огрызок от насекомых в пенопласт, пока клей не высохнет.
Затем аккуратно погладьте золотую проволоку, прикрепленную к огрызку насекомого, чтобы придать ей длинную мягкую дугу, и обрежьте проволоку примерно до 2,5-3 сантиметров в длину. Работая под диссекционным микроскопом, придерживайте огрызок насекомого за латунный гвоздь недоминантной рукой, пока золотая проволока касается предметного столика микроскопа для вскрытия, и возьмитесь за самый конец золотой проволоки тонкозаостренными щипцами доминирующей рукой, с помощью тонкоострических щипцов пересечь кончик золотой проволоки над медной проволокой огрызка насекомого рядом с склеенным участком. Затем аккуратно потяните за околок от насекомых, пока золотая проволока не образует маленькую золотую петлю вокруг тонкозаостренных щипцов.
Освободите золотую проволоку и осторожно снимите щипцы. Держа огрызок насекомого в недоминантной руке, возьмитесь за золотую петлю тонкоконечными щипцами. Потяните за огрызок от насекомых, слегка поворачивая щипцы в сторону от огрызка, пока петля не согнется под углом 90 градусов к горловине проволоки.
Убедитесь, что золотая петля полностью закрыта, прежде чем возвращать огрызок от насекомых в блок пенопласта. Для начала подготовьте аспиратор от насекомых и записывающие электроды для проводки комаров. Расположите комаров под наркозом на спине на анестезиологической салфетке животом лицом к исследователю.
После наложения лабораторного скотча нанесите на ленту 0,5-сантиметровую каплю свежесмешанного серебряного клея. Затем аспирируйте брюшную полость комара, находящегося под наркозом, в аспиратор. Использование отсасывания достаточно для того, чтобы усадить брюшную полость на место и удерживать комара под препарирующим эндоскопом над серебряным клеем с помощью аспиратора.
Обмакнув булавку минучина в серебряный клей, нанесите тонким слоем на переднеспинку комара. Быстро окуните золотую петлю на кончике записывающего электрода в серебряный клей. Поместите его на серебряное клеевое пятно на переднеспинке комара и покачивайте петлю вперед и назад, чтобы убедиться, что она сидит заподлицо.
Затем установите огрызок от насекомых в пенопласт под углом, который позволит комару удобно стоять, когда он проснется. Как только нужное количество комаров будет подключено, поместите блок пенопласта в ящик для хранения и обслуживайте его. Для начала прикрепите записывающие электроды к комарам в день эксперимента по электропенетографии или EPG.
Как только хост окажется на месте, поверните усилитель головы в сторону. После удаления проводного комара вставьте латунный штифт заглушки от насекомых в порт на головном усилителе. Начните запись с помощью программного обеспечения для управления оборудованием.
Расположите усилитель головы над рукой так, чтобы комар мог удобно стоять и прощупывать. Включите усилитель головы, находясь на земле. При необходимости отрегулируйте положение руки хозяина, чтобы помочь в успешном прощупывании.
Используйте программное обеспечение для управления оборудованием для выполнения наблюдений с отметками времени в отношении ответов хоста, поведения комаров, изменений усиления и других важных событий во время записи. Отрегулируйте положение сигналов на экране и программное усиление с помощью программного обеспечения для управления оборудованием, чтобы оба сигнала были четко видны. Чтобы отрегулировать аппаратное усиление, переключите переключатели диапазона и множителя первого канала.
Если этой регулировки недостаточно, поверните диск усиления для первого канала вправо или влево, чтобы увеличить или уменьшить усиление соответственно, чтобы избежать выпадения пиков или нечетких пиков. Для настройки смещения переверните переключатель смещения на один канал на блоке управления в положение «Нет». Затем поворачивайте диск смещения канала на один канал до тех пор, пока пики сигналов до и после не появятся в одном и том же направлении на экране компьютера.
Если комар находится в центре зонда, дайте ему закончить. Если в течение 10 минут датчик не сработает, выключите усилитель головки. Попросите хозяина осторожно убрать руку, затем удалите комара с помощью прикрепленного огрызка от насекомых.
Наконец, замените комара в ящике для хранения. Записи AC-DC EPG комаров Culex tarsalis, питающихся человеческими руками, позволили интерпретировать формы сигналов, пригодные для классификации по семействам, типам и подтипам.
