Этот протокол направлен на получение большого количества нестимулированных макрофагов, которые были получены из костного мозга и никогда не подвергались воздействию тканевых факторов или цитокинов. Основным преимуществом этой методики является количество клеток, полученных от одного животного. При правильной процедуре можно получить примерно 2 раза по 10 в степени 7 макрофагов.
Этот метод может помочь исследователям из различных областей, изучающих макрофаги, таких как клеточная биология, патология, иммунология и паразитология, поскольку клетки всегда восприимчивы к загрязнению, для поддержания жизнеспособности клеток необходимо соблюдать осторожность на всех стерильных этапах и использовать шкаф биобезопасности с ламинарным потоком. Демонстрировать процедуру будет Изабела Апаресида де Соуза. Магистрант нашей лаборатории.
Чтобы начать процедуру на правильно усыпленном восьминедельном самце мыши дикого типа C57BL/6, замочите мышь в 70% растворе этанола. С помощью стерильных ножниц сделайте разрез в один сантиметр вдоль живота и снимайте кожу до полного обнажения мышц задних лап. Затем аккуратно удалите задние ноги на высоте бедра, не ломая бедренную и большеберцовую кости.
Поместите неповрежденные задние ноги в коническую центрифужную пробирку, содержащую 70% раствор этанола. Внутри шкафа биобезопасности с ламинарным потоком переведите изолированные ножки с 70% этанола на стерильный PBS. С помощью щипцов и дезинфицирующих салфеток очистите кости, удалив все прикрепленные мышцы и фасции.
Затем с помощью стерильного лезвия хирургического скальпеля разрежьте костный эпифиз с обоих концов, обнажив костный мозг. Наполните 20-миллилитровый шприц 10 миллилитрами стерильного PBS с добавлением 2%-ного раствора пенициллина стрептомицина, и подсоедините к нему иглу 26-го калибра. Удерживайте кость с помощью анатомических рассекционных щипцов одной рукой.
Другой рукой введите иглу в костную полость осторожно, не раздавливая кость. Затем промойте внутреннюю часть кости с помощью PBS и соберите костный мозг в стерильную коническую центрифужную пробирку. После промывки костная полость должна казаться белой.
Центрифугируйте собранные клетки при температуре 300G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре среды DMEM/F1210. Гомогенизируйте суспензию и добавьте еще девять миллилитров среды, чтобы довести общий объем до 10 миллилитров.
Добавьте по одному миллилитру суспензии клеток-предшественников в каждую из 10 круглых пластиковых чашек Петри, размером 100 миллилитров на 20 миллиметров. Распределите ячейки по пластинам с помощью пипетки, чтобы получить равномерное распределение. Затем добавьте девять миллилитров DMEM/F1210 с добавлением 20% клеточного надосадочной жидкости L929 в каждое блюдо.
Инкубируйте посуду при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На третий день добавьте в каждое блюдо по 10 миллилитров среды DMEM/F1210 с добавлением 20% надосадочной жидкости L929 клеток. Полученных 20 миллилитров питательной среды в каждой чашке достаточно для роста клеток вплоть до созревания.
Откажитесь от надосадочной жидкости из всех блюд культуры. Вымойте каждую чашку для заквасок с 10 миллилитрами стерильного PBS без магния и кальция, предварительно подогретым до 37 градусов Цельсия, и выбросьте раствор после мытья. Добавьте в каждую посуду три миллилитра неферментативного раствора для диссоциации клеток, предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия.
Выдерживать в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Затем используйте инвертированный микроскоп, чтобы визуализировать, диссоциируют ли макрофаги из чашек для клеточных культур. С помощью серологической пипетки вымойте посуду раствором для неферментативной диссоциации клеток, многократно выполняя круговые движения, чтобы обеспечить полную диссоциацию макрофагов.
Соберите и соедините раствор со всех тарелок для культуры в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Еще раз добавьте в пустую посуду для культуры 10 миллилитров стерильного, предварительно подогретого PBS. Центрифугируйте коническую пробирку, содержащую объединенный собранный раствор, при температуре 300G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу одним миллилитром DMEM/F1210. Медленно и осторожно гомогенизируйте суспензию, пипетируя ее вверх и вниз, не повреждая клетки. Разведите 10 микролитров аликвоты раствора макрофага, добавив 10 микролитров трипанового синего для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
На седьмой день каждая чашка должна была произвести около 2 миллионов макрофагов. Воздействие макрофагального колониестимулирующего фактора из надосадочной жидкости L929 постепенно трансформировало предшественников костного мозга в зрелые макрофаги, демонстрируя типичную разбросанную морфологию за счет цитоплазматических расширений. На третий день появилось несколько незрелых макрофагов, имеющих типичную круглую форму морфологии с небольшим количеством мембранных выступов.
Несмотря на то, что они трансформировались на протяжении всего процесса, для достижения адекватного количества и зрелости потребовалось семь дней. Полученные макрофаги показали однородную популяцию по размеру и зернистости при анализе проточной цитометрии. Кроме того, 100% популяции экспрессировали характерные поверхностные молекулы F480 и CD11B, образуя единую четко определенную популяцию клеток.
Способность зрелых и хорошо дифференцированных макрофагов к фагоцитозу была подтверждена флуоресцентными микроскопическими изображениями, показывающими фагоцитозу основных паразитов Leishmania внутри макрофагов. Ноги следует удалять у животного осторожно, потому что это выполняется в нестерильной среде и является самым важным источником загрязнения. Ножки не должны быть сломаны за пределами шкафа биобезопасности с ламинарным потоком.
Макрофаги, полученные из костного мозга, полученные по этому протоколу, могут быть использованы для последующего выполнения поляризации макрофагов in vitro для понимания физиологии макрофагов.
