Ce protocole vise à obtenir de grandes quantités de macrophages non stimulés qui ont été dérivés de la moelle osseuse et qui n’ont jamais été exposés à des facteurs tissulaires ou à des cytokines. Le principal avantage de cette technique est le nombre de cellules acquises à partir d’un seul animal. Avec la bonne procédure, on peut obtenir environ 2 fois 10 à la puissance 7 macrophages.
Cette méthode pourrait aider les chercheurs de différents domaines qui étudient les macrophages tels que la biologie cellulaire, la pathologie, l’immunologie et la parasitologie, Parce que les cellules sont toujours sensibles à la contamination, il est nécessaire d’être prudent avec toutes les étapes stériles et d’utiliser une enceinte de biosécurité à flux laminaire pour maintenir la viabilité cellulaire. La démonstration de la procédure sera Izabela Aparecida de Souza. Un étudiant en Master de notre laboratoire.
Pour commencer la procédure sur la souris mâle de type sauvage C57BL/6 de huit semaines, correctement euthanasiée, trempez la souris avec une solution d’éthanol à 70 %. À l’aide de ciseaux stériles, faites une incision d’un centimètre le long de l’abdomen et retirez la peau jusqu’à ce que le muscle des pattes arrière soit complètement exposé. Retirez ensuite délicatement les postérieurs à la hauteur de la hanche sans casser le fémur et le tibia.
Mettez les pattes arrière intactes dans un tube de centrifugation conique contenant une solution d’éthanol à 70 %. À l’intérieur d’une enceinte de biosécurité à flux laminaire, transférez les pattes isolées de l’éthanol à 70 % vers du PBS stérile. À l’aide de pinces et de lingettes désinfectantes, nettoyez les os en enlevant tous les muscles et les fascias attachés.
Ensuite, utilisez une lame de scalpel chirurgicale stérile pour couper l’épiphyse osseuse aux deux extrémités, exposant ainsi la moelle osseuse. Remplissez une seringue de 20 millilitres avec 10 millilitres de PBS stérile complété par une solution de streptomycine de pénicilline à 2 %, et connectez-y une aiguille de calibre 26. Tenez l’os à l’aide d’une pince de dissection anatomique d’une main.
Utilisez l’autre main pour insérer l’aiguille dans la cavité osseuse avec précaution sans écraser l’os. Ensuite, lavez l’intérieur de l’os avec du PBS et collectez la moelle osseuse dans un tube à centrifuger conique stérile. Une fois lavée, la cavité osseuse doit apparaître blanche.
Centrifugez les cellules collectées à 300 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu DMEM/F1210. Homogénéisez la suspension et ajoutez neuf millilitres supplémentaires du fluide pour porter le volume total à 10 millilitres.
Ajoutez un millilitre de suspension de cellules progénitrices dans chacune des 10 boîtes de Pétri rondes en plastique, mesurant 100 millilitres sur 20 millimètres. Répartissez les cellules sur les plaques à l’aide d’une pipette pour obtenir une distribution uniforme. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de DMEM/F1210 complété par 20 % de surnageant cellulaire L929 dans chaque plat.
Incuber les plats à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le troisième jour, ajoutez 10 millilitres de milieu DMEM/F1210 complété par 20 % de surnageant cellulaire L929 dans chaque plat. Les 20 millilitres de milieu de culture qui en résultent dans chaque plat sont suffisants pour la croissance cellulaire jusqu’à la maturation.
Jetez les surnageants de tous les plats de culture. Lavez chaque plat de culture avec 10 millilitres de PBS stérile sans magnésium ni calcium, préchauffé à 37 degrés Celsius, et jetez la solution après le lavage. Ajoutez trois millilitres de solution de dissociation cellulaire non enzymatique, préchauffée à 37 degrés Celsius dans chaque plat.
Incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, utilisez un microscope inversé pour visualiser si les macrophages se dissocient des boîtes de culture cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique, laver la vaisselle avec la solution de dissociation cellulaire non enzymatique en effectuant des mouvements circulaires répétés pour assurer une dissociation complète des macrophages.
Recueillir et combiner la solution de toutes les boîtes de culture dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres. Une fois de plus, ajoutez 10 millilitres de PBS stérile et préchauffé dans les boîtes de culture vides. Centrifugez le tube conique contenant la solution collectée combinée à 300 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension avec un millilitre de DMEM/F1210. Homogénéisez la suspension lentement et soigneusement en la pipetant de haut en bas sans endommager les cellules. Diluez une aliquote de 10 microlitres de la solution de macrophage en ajoutant 10 microlitres de bleu de trypan pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
Au septième jour, chaque plat produirait environ 2 millions de macrophages. L’exposition au facteur de stimulation des colonies de macrophages par le surnageant L929 a progressivement transformé les progéniteurs de la moelle osseuse en macrophages matures, affichant une morphologie étalée typique due à des extensions cytoplasmiques. Le troisième jour, quelques macrophages immatures sont apparus, ayant une morphologie ronde typique avec peu de projections membranaires.
Bien qu’ils se soient transformés tout au long du processus, sept jours ont été nécessaires pour atteindre un nombre et une maturité adéquats. Les macrophages obtenus ont montré une population homogène en termes de taille et de granularité dans l’analyse par cytométrie en flux. De plus, 100 % de la population exprimait les molécules de surface caractéristiques F480 et CD11B, formant une seule population bien définie de cellules.
La capacité de phagocytose des macrophages matures et bien différenciés a été confirmée par des images de microscopie à fluorescence montrant la phagocytose des principaux parasites Leishmania à l’intérieur des macrophages. Les pattes doivent être retirées de l’animal avec précaution car cela se fait dans un environnement non stérile et constitue la source de contamination la plus importante. Les pieds ne doivent pas être cassés à l’extérieur de l’enceinte de biosécurité à flux laminaire.
Les macrophages dérivés de la moelle osseuse obtenus à partir de ce protocole peuvent être utilisés pour effectuer ultérieurement une polarisation in vitro des macrophages afin de comprendre la physiologie des macrophages.
