В то время как искусственное мембранное кормление было сделано раньше, наш протокол проще в настройке и адаптируется к другим видам клещей с некоторыми изменениями. Основным преимуществом искусственного мембранного кормления является то, что оно позволяет подвергать воздействию патогенов и методов лечения, которые могут быть невозможны при кормлении животных. Эта система искусственного мембранного питания может быть применена к другим видам членистоногих с некоторым тестированием на идеальные фагостимуляторы и модификации идеальной толщины мембраны.
Производство правильной толщины мембраны требует некоторой практики. Обязательно используйте микрометр для измерения толщины в нескольких местах на мембране. Бенджамин Калл, постдок в нашей лаборатории, поможет мне продемонстрировать процедуру.
Для начала протрите плоскую, непористую поверхность, такую как стеклянное или керамическое покрытие металлической основы подставки для рук с 70% этанолом, а затем покройте ее одним слоем полиэтиленовой пленки. Убедитесь, что полиэтиленовая пленка плоская и без пузырьков или морщин. Приклейте 100% бумагу для очистки вискозной линзы на подготовленную поверхность.
Убедитесь, что он плоский и слегка натянутый с помощью ленты на всех четырех сторонах бумаги. Подготовьте силиконовую смесь твердости 0010, отмерив пять миллилитров каждой части силиконового комплекта в одноразовый контейнер. Слегка перемешайте две жидкости и добавьте 1,5 миллилитра гексана.
Продолжайте перемешивать до тех пор, пока смесь не станет однородной и тщательно перемешана. Используйте небольшой скребок, чтобы распределить силиконовую смесь по бумаге для линз и дайте ей постоять в течение одной минуты, чтобы убедиться, что силикон впитался в бумагу для линз. Неуклонно соскребайте избыток силикона в сторону с помощью скребка, используя небольшое количество нисходящего давления.
Выполните второй проход со скребком, не оказывая давления вниз, чтобы удалить любые линии силикона и получить гладкий слой. Только для личинок окуните верхнюю часть камеры подачи в фторполимерную смолу Fluon несколько раз, что позволит ей высохнуть между применениями, чтобы получить последовательный слой. Оставьте мембрану для отверждения в течение не менее 24 часов в свободной от пыли среде, такой как закрытый химический шкаф или шкаф биобезопасности.
Затем смешайте равные части силиконовой смеси А и В, чтобы приготовить силиконовую смесь 30 твердости для прикрепления камер к мембране. Опустите поликарбонатные камеры примерно на четверть дюйма в силиконовую смесь, а затем поместите их на мембранный лист, следя за тем, чтобы не перекрывать ни одну из лент. Дайте прикрепляющему силикону затвердеть не менее 24 часов.
С помощью скальпеля аккуратно обрежьте мембрану вокруг каждой из прикрепленных камер, обрезав края так, чтобы она могла плавно вписаться в колодец из шести лунок пластины без особого соскабливания по бокам. Допустите достаточное количество материала за пределы камеры, чтобы максимизировать добавление мембраны. Отрежьте небольшой кусочек оставшейся мембраны от каждого угла и центра мембранного листа.
Снимите полиэтиленовую пленку с каждого куска и измерьте кусочки микрометром, чтобы определить среднюю толщину мембраны. Поместите питательные камеры вместе с одним уплотнительным кольцом на камеру в стеклянный стакан для автоклавирования при температуре 121 градус Цельсия в течение не менее 20 минут для стерилизации. Дайте камерам остыть перед их использованием.
После извлечения предварительно подготовленных автоклавных мембранных камер и размещения уплотнительного кольца вокруг них, заполните каждую камеру достаточным количеством этанола на 70%, чтобы покрыть мембрану. Дайте ему посидеть в шестилуночной пластине в течение пяти минут, а затем найдите любые утечки между камерой и мембраной и в самой мембране. Выпустите этанол из камер, а затем дайте ему высохнуть на воздухе внутри шкафа биобезопасности или ламинарной вытяжки.
Чтобы нагреть и активировать комплемент в крови, нагревайте его при 56 градусах Цельсия в течение 40 минут и дополняйте механически дефибрилированную бычью кровь двумя граммами на литр глюкозы. Как только мембрана высохнет, нанесите около 20 микролитров фагостимулятора на внутреннюю часть камеры и наклоните камеру, чтобы распределить ее по поверхности. Когда фагостимулятор высохнет, быстро добавьте клещей в камеру либо щеткой, либо щипцами.
Запечатайте верхнюю часть парапленкой, так как тепло от водяной бани может привести к ее разрыву. Затем добавьте пять миллилитров тепла и активированной крови на лунку или камеру в коническую трубку и поместите ее на водяную баню, установленную при 36 градусах Цельсия. Добавьте пять микролитров трех миллимоляров АТФ и 50 микролитров 100-кратного запаса пенициллина стрептомицинового фунгизона на пять миллилитров крови в пробирку и переложите 4,5 миллилитра крови в лунку из шестилуночной пластины.
Аккуратно поместите камеру в колодец, регулируя высоту уплотнительного кольца на камере так, чтобы мембрана сидела в крови, но уровень крови вокруг стороны не перекрывал колодец. Затем поместите колодец в кровь под углом, чтобы избежать образования пузырьков воздуха между кровью и мембраной. Поместите крышку тарелки из шести лунок поверх камер подачи.
Поместите тарелку с шестью лунками в подготовленную водяную баню 34 градуса Цельсия и крышку. Добавьте пять микролитров трех миллимоляров АТФ и 50 микролитров 100-кратного запаса пенициллина стрептомицинового фунгизона на лунку в пробирку крови и перенесите 4,5 миллилитра крови в лунку из свежей шестилуночной пластины, как показано ранее. Выньте из водяной бани пластину из шести лунок с клещевой камерой и извлеките камеру из колодца.
Промыть внешнюю часть камеры и мембрану 10 миллилитрами стерилизованного 1X PBS для удаления крови. Используя автоклавную фильтровальную бумагу, аккуратно высушите мембрану и камеру, чтобы удалить избыток PBS. Если внутри камеры много конденсата, высушите влажные пятна автоклавной фильтровальной бумагой, прежде чем герметизировать ее свежей парапленкой.
Затем замените парапленку на верхней части камеры. Поместите клещевую камеру в новую шестилуночную пластину со свежей кровью, при необходимости регулируя высоту уплотнительного кольца. Повторите эти шаги для каждой камеры на пластине.
Наконец, поместите крышку пластины из шести скважин поверх камер и переместите новую пластину с шестью скважинами обратно на водяную баню с температурой 34 градуса Цельсия. Здесь показано продолжающееся кормление с частично набухшими нимфами ixodes scapularis. Черные или коричневые точки вокруг мест прикрепления - это инеи, которые могут быть собраны во время и после кормления, чтобы сделать фагостимулятор.
Частично набухшие иксоды лопаточной нимфы видны прикрепленными к мембране. Здесь также можно увидеть шелуху набухшей плесени личинок. В этой таблице представлены цифры набухания клещей и массы яиц.
В экспериментальных условиях личиночного и нимфального нагрубания в кровь добавлялся гомогенат органа оленя в дополнение к добавкам, используемым в этой технике. Здесь успешное нагрубание определялось либо набухшими клещами, которые успешно линяли до следующей живой стадии, либо набухшими самками, которые успешно откладывали яйца. Требуется практика, чтобы получить приемлемую толщину при нанесении силикона на бумагу для линз, поэтому всегда важно измерить толщину мембраны перед использованием.
Мембранное кормление может подвергать клещей воздействию патогенов или антибиотиков. Влияние их на аспекты биологии клещей, такие как успех линьки, откладка яиц и выживание, можно оценить после кормления.
