Embora a alimentação artificial por membrana já tenha sido feita antes, nosso protocolo é mais simples de configurar e adaptável a outras espécies de carrapatos com algumas modificações. A principal vantagem da alimentação artificial por membrana é que ela permite a exposição a patógenos e tratamentos que podem não ser viáveis através da alimentação animal. Este sistema de alimentação por membrana artificial pode ser aplicado a outras espécies de artrópodes com alguns testes para fagostimulantes ideais e modificações na espessura ideal da membrana.
Produzir a espessura correta da membrana requer alguma prática. Certifique-se de usar um micrômetro para medir a espessura em vários locais da membrana. Benjamin Cull, um pós-doutorando em nosso laboratório me ajudará a demonstrar o procedimento.
Para começar, limpe uma superfície plana e não porosa, como um painel de vidro ou base de metal revestida de cerâmica de um suporte de braço com etanol a 70% e, em seguida, cubra-a com uma única camada de filme plástico. Certifique-se de que o filme plástico é plano e sem bolhas ou rugas. Tape 100% rayon papel de limpeza da lente para a superfície preparada.
Certifique-se de que está plano e ligeiramente tenso com fita adesiva em todos os quatro lados do papel. Prepare a mistura de silicone de dureza 0010 medindo cinco mililitros de cada parte do kit de silicone em um recipiente descartável. Misture levemente os dois líquidos e adicione 1,5 mililitros de hexano.
Continue misturando até que a mistura esteja homogênea e completamente misturada. Use um rodo pequeno para distribuir a mistura de silicone sobre o papel da lente e deixe-a repousar por um minuto para garantir que o silicone tenha embebido no papel da lente. De forma constante, raspe o excesso de silicone para o lado com o rodo usando uma pequena quantidade de pressão para baixo.
Execute uma segunda passagem com o rodo sem exercer a pressão descendente para remover quaisquer linhas de silicone e produzir uma camada lisa. Apenas para larvas, mergulhe o topo da câmara de alimentação na resina de fluoropolímero Fluon várias vezes, permitindo que ela seque entre as aplicações para produzir uma camada consistente. Deixe a membrana para curar por pelo menos 24 horas em um ambiente livre de poeira, como um armário químico ou de biossegurança fechado.
Em seguida, misture partes iguais da mistura de silicone A e B para preparar a mistura de silicone de dureza 30 para anexar as câmaras à membrana. Mergulhe as câmaras de policarbonato cerca de um quarto de polegada na mistura de silicone e, em seguida, coloque-as na folha de membrana, tomando cuidado para não sobrepor nenhuma das fitas. Deixe o silicone de fixação curar por pelo menos 24 horas.
Usando um bisturi, corte cuidadosamente a membrana em torno de cada uma das câmaras anexadas, aparando as bordas para que ela possa se encaixar suavemente em um poço da placa de seis poços sem muita raspagem nas laterais. Deixe material suficiente fora da câmara para maximizar a adição da membrana. Corte um pequeno pedaço da membrana que sobra de cada canto e o centro da folha de membrana.
Remova o filme plástico de cada peça e meça as peças com um micrômetro para determinar a espessura média da membrana. Coloque as câmaras de alimentação juntamente com um O-ring por câmara em um copo de vidro para ser autoclavado a 121 graus Celsius por pelo menos 20 minutos para esterilizar. Deixe as câmaras esfriarem antes de usá-las.
Depois de retirar as câmaras de membrana autoclavadas pré-preparadas e colocar o anel O em torno delas, encha cada câmara com etanol suficiente a 70% para cobrir a membrana. Deixe descansar em uma placa de seis poços por cinco minutos e, em seguida, procure por quaisquer vazamentos entre a câmara e a membrana e na própria membrana. Esvazie o etanol das câmaras e, em seguida, deixe-o secar ao ar dentro de um gabinete de biossegurança ou exaustor de fluxo laminar.
Para aquecer e ativar o complemento no sangue, aqueça-o a 56 graus Celsius por 40 minutos e complemente o sangue bovino desfibrilado mecanicamente com dois gramas por litro de glicose. Uma vez que a membrana esteja seca, aplique cerca de 20 microlitros de fagostimulante no interior da câmara e incline a câmara para espalhá-la pela superfície. Quando o fagostimulante estiver seco, adicione rapidamente os carrapatos à câmara com uma escova ou pinça.
Sele o topo com parafilme, pois o calor do banho-maria pode fazer com que ele rasgue. Em seguida, adicione cinco mililitros de calor e sangue ativado por poço ou câmara em um tubo cônico e coloque-o no banho-maria a 36 graus Celsius. Adicione cinco microlitros de três milimolares de ATP e 50 microlitros de 100X de estoque de penicilina estreptomicina fungizona por cinco mililitros de sangue para o tubo e transfira 4,5 mililitros de sangue para um poço de uma placa de seis poços.
Coloque suavemente a câmara no poço, ajustando a altura do anel O na câmara para que a membrana fique no sangue, mas o nível sanguíneo ao redor do lado não sobrecarregue o poço. Em seguida, coloque o poço no sangue em um ângulo para evitar a formação de bolhas de ar entre o sangue e a membrana. Coloque a tampa da placa de seis poços em cima das câmaras de alimentação.
Coloque a placa de seis poços com câmaras no banho de água preparado a 34 graus Celsius e na tampa. Adicione cinco microlitros de três milimolares de ATP e 50 microlitros de 100X de estoque de penicilina estreptomicina fungizona por poço para o tubo de sangue e transfira 4,5 mililitros de sangue para um poço de uma placa fresca de seis poços, como mostrado anteriormente. Retire a placa de seis poços com a câmara de carrapatos do banho-maria e remova a câmara do poço.
Lave o exterior da câmara e da membrana com 10 mililitros de PBS 1X esterilizado para remover o sangue. Usando papel de filtro autoclavado, seque suavemente a membrana e a câmara para remover o excesso de PBS. Se houver muita condensação dentro da câmara, seque as manchas molhadas com papel de filtro autoclavado antes de selá-lo com parafilme fresco.
Em seguida, substitua o parafilme no topo da câmara. Coloque a câmara de carrapatos na nova placa de seis poços com sangue fresco, ajustando a altura do O-ring, se necessário. Repita estes passos para cada câmara na placa.
Finalmente, coloque a tampa da placa de seis poços sobre o topo das câmaras e mova a nova placa de seis poços de volta para o banho de água de 34 graus Celsius. Uma alimentação contínua com ninfas ixodes scapularis parcialmente ingurgitadas é mostrada aqui. Os pontos pretos ou marrons ao redor dos locais de fixação são a geada que pode ser coletada durante e após a alimentação para fazer o fagostimulante.
Ninfas ixodes scapularis parcialmente ingurgitadas são vistas ligadas à membrana. Uma casca do mofo de larvas ingurgitadas também pode ser vista aqui. Os números de ingurgitamento de carrapatos e os pesos de massa de ovos são apresentados nesta tabela.
As condições experimentais de ingurgitamento larval e ninfal tiveram homogeneizado de órgão de veado adicionado ao sangue, além dos suplementos utilizados nesta técnica. Aqui, o ingurgitamento bem-sucedido foi definido como carrapatos ingurgitados que se mudaram com sucesso para o próximo estágio vivo ou fêmeas ingurgitadas que colocaram ovos com sucesso. É preciso prática para obter espessura aceitável ao aplicar silicone ao papel da lente, por isso é sempre importante medir a espessura da membrana antes do uso.
A alimentação por membrana pode expor carrapatos a patógenos ou antibióticos. Os efeitos destes em aspectos da biologia do carrapato, como o sucesso da muda, a postura de ovos e a sobrevivência, podem ser avaliados após a alimentação.
