Механизм устойчивости к порообразующим токсинам плохо изучен. Наш протокол обеспечивает функционирование и механизм формирования пор токсинов с использованием Leishmania major, генетически трактуемой и физиологически значимой системы. Основным преимуществом анализа цитотоксичности является сравнение жизнеспособности клеток нескольких фенотипов на уровне одной клетки в анализе средней пропускной способности при оспаривании токсинов в режиме реального времени.
Мембранные возмущающие агенты, такие как амфотерицин B, являются передовыми методами лечения лейшмании. Этот анализ позволяет идентифицировать агенты, которые потенцируют амфотерицин B и / или новые агенты, повреждающие мембрану. Этот анализ дает представление о таких областях, как реакция на восстановление и сигнальные пути, связанные с реакциями восстановления.
Этот анализ может быть применен к простейшим, таким как Trypanosoma и Naegleria fowleri. Людям трудно понять серию последовательного разбавления токсинов. Поэтому лучший совет, который я могу дать, это нарисовать схему последовательного разбавления перед началом эксперимента.
Для начала зарезервируйте 0,5 миллилитра обработанных промастиготов в отдельной пробирке в качестве незапятнанного контроля. Добавьте два миллиграмма на миллилитр пропидия йодида, или PI, до конечной концентрации 10 микрограмм на миллилитр к оставшимся промастиготам. Вихрь в течение трех секунд.
Добавьте обработанные промастиготы в каждую лунку V-образного дна, плиты из 96 скважин или болотных труб и поместите пластину или трубчатую стойку на лед под углом обзора примерно 45 градусов. Добавьте 100 микролитров буфера анализа с йодидом пропидия к каждому контролю без токсинов. Убедитесь, что элемент управления был добавлен правильно, визуально идентифицируя трубки общим объемом 200 микролитров, которые кажутся темнее по цвету.
Добавьте объем токсина в наибольшее разведение. Затем последовательно разбавляют токсин. Пипетка вверх и вниз не менее восьми раз, чтобы обеспечить смешивание.
Начиная с самой низкой концентрации токсина, быстро добавьте 100 микролитров токсина в правильный ряд и продолжайте до тех пор, пока весь токсин не будет добавлен в клетки. Запечатайте пластину уплотнительной лентой. После инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут упакуйте и транспортируйте пластину к проточному цитометру.
Для сбора данных начните с настройки проточного цитометра и программного обеспечения для сбора в соответствии с инструкциями производителя и политикой для каждого объекта. Используя неокрашенный образец L.major promastigote, установите затворы для прямого и бокового рассеяния и исходные флуоресцентные параметры на основе выбранных красителей. Используя одноокрашенные элементы управления, установите затворы для жизнеспособности красителя и любых флуоресцентно меченых токсинов.
Отслеживайте прямое рассеяние по сравнению со временем для микроклогов и получайте более 10 000 закрытых событий для каждого образца на цитометре. Для анализа данных затвор общих одноэлементных L.major promastigotes путем наведения на передний и боковой разброс и время по мере необходимости. Используйте высоту или площадь, как рекомендуется для проточного цитометра.
Идентифицируйте и защищайте мертвые клетки как высокие PI. Организуйте кривую «доза-реакция» в Excel для анализа. Определите средний процент PI для каждого условия между двумя техническими репликами.
Включите концентрацию токсина и средний процент специфического лизиса, а также экспериментальные детали и / или необработанные процентные расчеты PI. Пометьте еще четыре столбца как «Смоделированные», «Остаточные», «Параметры» и «Значения параметров». Убедитесь, что первые столбцы соответствуют экспериментальным параметрам, концентрации токсина и проценту специфического лизиса.
Инициализируйте параметры L, k и c, введя значения в столбец Значения параметров. В столбце Смоделировано создайте логистическую модель. В столбце Остатки вычислите квадрат разности между смоделированным числом и фактическим конкретным лизисом.
В столбце Значения параметров рядом с суммой суммируйте все значения в столбце Остатки. В столбце Значения параметров рядом с LC50 инициализируйте уравнение, чтобы вычислить LC50 из определенных значений. Откройте средство поиска решения на вкладке Данные.
Выберите заданное целевое значение ячейки, содержащей сумму рассчитанных остатков. Установите для него значение Min. Измените ячейки переменных для значений параметров L, k и c.
Для отрицательных значений k модифицируйте уравнения, умножая отрицательное уравнение от k к изменению k на положительное. Используйте метод нелинейного решения GRG и нажмите кнопку Решить. Проверьте кривую и то, что LC50 вычисляется автоматически.
Проверьте соответствие, графически построив график как процент специфического лизиса, так и моделирование концентрации токсина. Нокаутирующие промастиготы SPT2 с дефицитом сфинголипидов были чувствительны к SLO как в бессывороточном M199, так и в буфере Tyrode. Дикий тип и добавочные промастиготы SPT2 были устойчивы к SLO в бессывороточном M199, но имели менее 20% специфического лизиса в буфере Tyrode.
Нокаутирующие промастиготы SPT2 были примерно в восемь раз более чувствительны к SLO в буфере Tyrode, чем в M199. Эти данные демонстрируют, что чувствительность к токсинам может варьироваться в зависимости от используемого буфера. 120-килодальтонная полоса наблюдалась для фосфо-MEK в L.major promastigotes.
Для общего MEK наблюдались полосы на уровне около 120 килодалтон и 55 килодалтон, которые согласуются с размерами MRK1 и LmxMKK соответственно. Phospho-ERK обнаружил аналогичные полосы, в то время как окрашивание антител ERK не было надежным в этом анализе. Самое важное, что нужно помнить при попытке этой процедуры, это обеспечение правильного обращения с токсином.
Лейшмания может быть использована в качестве генетически трактуемой модели для изучения восстановления плазматической мембраны, предоставляя новое понимание механики восстановления мембран во время взаимодействия бактерий Лейшмании в средней кишке песчаной мухи.
