Il meccanismo di resistenza alle tossine che formano i pori è poco conosciuto. Il nostro protocollo consente la funzione e il meccanismo per formare le tossine che formano i pori utilizzando Leishmania major, un sistema geneticamente trattabile e fisiologicamente rilevante. Il principale vantaggio del test di citotossicità è il confronto della vitalità cellulare di più fenotipi a livello di singola cellula in un test a medio rendimento quando viene sfidato con tossine in tempo reale.
Gli agenti che perturbano la membrana come l'amfotericina B sono terapie di prima linea per la Leishmania. Questo test consente l'identificazione di agenti che potenziano l'amfotericina B e/o nuovi agenti dannosi per la membrana. Questo test fornisce informazioni su aree quali la risposta alla riparazione e i percorsi di segnalazione relativi alle risposte di riparazione.
Questo test può essere applicato a protozoi come Trypanosoma e Naegleria fowleri. Le persone trovano difficile capire la serie di diluizioni seriali delle tossine. Quindi il miglior consiglio che posso dare è quello di disegnare uno schema della serie di diluizione seriale prima di impostare l'esperimento.
Per iniziare, riservare 0,5 millilitri di promastigoti trasformati in un tubo separato come controllo non colorato. Aggiungere due milligrammi per millilitro di ioduro di propidio, o PI, a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro ai promastigoti rimanenti. Vortice per tre secondi.
Aggiungere promastigoti lavorati a ciascun pozzetto di una piastra con fondo a V, 96 pozzetti o tubi di Marsh e posizionare la piastra o il rack del tubo sul ghiaccio con un angolo di circa 45 gradi dalla visualizzazione. Aggiungere 100 microlitri di tampone di dosaggio con ioduro di propidio a ciascun controllo senza tossine. Verificare che il controllo sia stato aggiunto correttamente identificando visivamente tubi con un volume totale di 200 microlitri che appaiono di colore più scuro.
Aggiungere il volume della tossina alla massima diluizione. Quindi, diluire serialmente la tossina. Pipettare su e giù almeno otto volte per garantire la miscelazione.
Partendo dalla concentrazione di tossine più bassa, aggiungere rapidamente 100 microlitri di tossina alla riga corretta e continuare fino a quando tutta la tossina è stata aggiunta alle cellule. Sigillare la piastra con nastro sigillante. Dopo l'incubazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, imballare e trasportare la piastra al citometro a flusso.
Per l'acquisizione dei dati, iniziare con la configurazione del citometro a flusso e del software di acquisizione in base alle istruzioni del produttore e alla politica dell'impianto. Utilizzando il campione di promastigote L.major non colorato, impostare le porte per la dispersione anteriore e laterale e i parametri fluorescenti iniziali in base ai coloranti scelti. Utilizzando controlli a macchia singola, impostare le porte per il colorante di vitalità e qualsiasi tossina etichettata con fluorescenza.
Monitorare la dispersione in avanti rispetto al tempo per i microclog e acquisire più di 10.000 eventi controllati per ciascun campione sul citometro. Per l'analisi dei dati, il gate totale di L.major a cella singola promuove il gating su scatter avanti e laterale e il tempo secondo necessità. Utilizzare l'altezza o l'area come raccomandato per il citometro a flusso.
Identifica e cancella le cellule morte come PI alto. Organizzare la curva dose-risposta in Excel per l'analisi. Determinare la percentuale media di PI elevata per ogni condizione tra le due repliche tecniche.
Includere la concentrazione di tossine e la percentuale media di lisi specifica, insieme a dettagli sperimentali e / o calcoli percentuali grezzi di PI elevato. Etichettare altre quattro colonne come Modeled, Residuals, Parameters e Parameter Values. Verificare che le prime colonne corrispondano ai parametri sperimentali, alla concentrazione di tossine e alla percentuale di lisi specifica.
Inizializzare i parametri L, k e c immettendo i valori nella colonna Valori parametro. Nella colonna Modellato creare il modello logistico. Nella colonna Residui, calcolare il quadrato della differenza tra il numero modellato e la lisi specifica effettiva.
Nella colonna Valori parametri, accanto a SOMMA, sommare tutti i valori nella colonna Residui. Nella colonna Valori parametri, accanto a LC50, inizializzare l'equazione per calcolare LC50 dai valori determinati. Aprire il Risolutore dalla scheda Dati.
Selezionare l'obiettivo impostato come cella contenente la somma dei residui calcolati. Impostarlo su Min. Modificare le celle delle variabili per i valori dei parametri L, k e c.
Per k valori negativi, modificare le equazioni estrazionando quella negativa da k per cambiare k in positivo. Utilizzate il metodo di risoluzione non lineare GRG e fate clic su Risolvi (Solve). Controllare la curva e che la LC50 venga calcolata automaticamente.
Verificare l'adattamento tracciando graficamente sia la percentuale di lisi specifica che la modellazione rispetto alla concentrazione di tossine. I promastigoti knockout SPT2 carenti di sfingolipidi erano sensibili allo SLO sia nell'M199 privo di siero che nel tampone di Tyrode. I promastigoti di tipo selvatico e SPT2 erano resistenti allo SLO in M199 privo di siero, ma avevano meno del 20% di lisi specifica nel tampone di Tyrode.
I promastigoti knockout SPT2 erano circa otto volte più sensibili allo SLO nel buffer di Tyrode rispetto a M199. Questi dati dimostrano che la sensibilità alle tossine può variare in base al tampone utilizzato. Una banda di 120 kilodalton è stata osservata per il fosfo-MEK nei proplasiti maggiori.
Per il MEK totale, sono state osservate bande a circa 120 kilodalton e 55 kilodalton, che sono coerenti con le dimensioni di MRK1 e LmxMKK, rispettivamente. Phospho-ERK ha rilevato bande simili, mentre la colorazione anticorpale ERK non era robusta in questo test. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è garantire la corretta gestione della tossina.
La leishmania può essere utilizzata come modello geneticamente trattabile per studiare la riparazione della membrana plasmatica, fornendo nuove informazioni sulla meccanica di riparazione della membrana durante l'interazione dei batteri Leishmania nel midgut dei sandfly.
