Астроциты являются интересной аутогенной популяцией для прямого нейронного программирования. Данный протокол обеспечивает надежную методику выделения культуры астроцитов высокой чистоты из разных областей или центральной нервной системы. Этот протокол разработан и оптимизирован для исследования способности астроцитов перепрограммироваться в функциональные нейроны без смешивания факторов, таких как различия в чистоте астроцитов в разных стартап-популяциях.
Демонстрация процедуры будет сделана Бобом Херсбахом, постдоком в лаборатории, и Татьяной Саймон, которая будет оказывать техническую помощь в нашей лаборатории. Для начала поместите туловище усыпленной мыши в 35-миллиметровую чашку Петри и держите ее на льду. Откройте кожу ножницами и удалите позвонок мелкими ножницами.
Затем извлеките спинной мозг и поместите его в рассеченный буфер на льду. Под стереотаксическим рассеченным микроскопом с двукратным увеличением удаляют мозговые оболочки из изолированных спинных мозгов с помощью щипцов и переносят рассеченную и очищенную ткань спинного мозга в трубку С. Добавьте 50 микролитров фермента Р из набора диссоциации нервной ткани и 30 микролитров предварительно приготовленной ферментной смеси в каждую трубку С.
Переверните трубки C и поместите их на нагретый диссоциированный, гарантируя, что вся ткань собрана в крышке трубки. Ускользайте от клеток, удаляя колонку из сепаратора, добавляя 800 микролитров культуральной среды астроцитов и выталкивая клетки из колонны с включенным плунжером. Пластинчатые клетки в предварительно подготовленные культуральные колбы путем добавления 4,2 миллилитров культуральной среды астроцитов дополняют 10 нанограммами на миллилитры EGF и bFGF.
Нет необходимости покрывать колбы культуры для астроцитов, выделенных из других областей мозга, но это обеспечивает лучший субстрат для астроцитов, выделенных из спинного мозга. Культивируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Выполните рассадку астроцитов под шкафом биологической безопасности с уровнем безопасности и подготовьте 24 пластины скважины со стеклянными крышками с поли-D-лизинным покрытием, как описано в текстовой рукописи.
Для покрытия изолируйте шесть спинных мозгов от мышей P2, что дает около 1 миллиона клеток. Аспиратные среды из колб культуры Т-12,5, содержащих культивируемые астроциты, промывают один раз 1x PBS. Отделите астроциты от колбы культуры, добавив 0,5 миллилитра 0,05% трипсина ЭДТА и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Осторожно постучите по боковой стороне колбы, чтобы освободить клетки от поверхности колбы культуры, и проверьте отслоение под микроскопом яркого поля, используя 10-кратное увеличение. Прекратить трипсиназацию 2,5 миллилитрами культуральной среды астроцитов и собрать клеточную суспензию в 15 миллилитровых пробирках. Центрифуга при 300 RCF в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Аспират супернатант и повторно отправляют клетки в одном миллилитре культуральной среды астроцитов. Рассчитайте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированной системы подсчета клеток. Исходя из количества клеток, разбавляют клеточную суспензию свежей астроцитарной средой, дополненной EGF и bFGF по 10 нанограмм на миллилитр на фактор.
Добавьте 500 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку из предварительно подготовленных 24 луночных пластин и культивируемых клеток при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Готовят нейронную дифференцировочную среду, добавляя один миллилитр добавки B27 к 49 миллилитрам основной питательной среды. Через 24-48 часов, в зависимости от того, были ли клетки трансдуцированы или трансфектированы, замените астроцитарную среду одной миллилитрной нейрональной дифференцировочной средой на лунку.
Культивируйте клетки при 37 градусах Цельсия с 9% углекислого газа. Для повышения эффективности перепрограммирования дополняют нейронную дифференцировочную среду форсколином и дорсоморфином до конечной концентрации 30 микромоляров и одного микромоляра соответственно при замене астроцитарной среды дифференцировочной средой. При выборе лечения клеток форсколином и дорсоморфином назначают вторую дозу дорсоморфина через два дня после начала лечения.
Добавьте эту вторую обработку непосредственно в культуральную среду. Первичные культуры астроцитов достигали от 80 до 90% слияния между семью и 10 днями после магнитной сортировки клеток и покрытия. На следующий день после покрытия клетки обычно покрывают от 50 до 60% поверхности покрытия.
Культуры в основном состояли из астроцитов на этом этапе, в то время как другие типы клеток, такие как нейробласты, практически отсутствовали. Через семь дней после трансдукции или трансфекции индуцированные нейрональные клетки были четко отличимы от астроцитов. Сома нейрональных клеток была меньше, чем непрограммированные Астроциты имели длительные процессы и были положительными для нейронного маркера, бета-три тубулина, и отрицательными для астроцитарного маркера GFAP.
Через 21 день после трансдукции или трансфекции многие индуцированные нейроны были способны запускать потенциалы действия и были положительными для зрелого нейронного маркера NeuN и пансинаптического белка Synaptophysin. Важно правильно проанализировать интересующий регион. Предотвращение загрязнения окружающих тканей.
Необходимо позаботиться об удалении мозговых оболочек и корневых ганглиев дорсо из изолированного спинного мозга. Этот метод может быть использован для выделения астроцитов из различных областей центральной нервной системы, включая кору головного мозга, дорсальный средний мозг и мозжечок. В будущем эта методика позволит нам расширить наши знания о регионарных астроцитах и их потенциале перепрограммирования в функциональные нейроны.
