アストロサイトは、直接的なニューロンプログラミングの対象となる興味深い自生集団です。このプロトコルは、異なる領域または中枢神経系から高純度の培養アストロサイトを単離するための信頼できる技術を提供します。このプロトコルは、異なるスタートアップ集団のアストロサイトの純度の違いなどの交絡因子なしに、アストロサイトが機能ニューロンに再プログラムされる能力を調査するように設計および最適化されています。
手順のデモンストレーションは、研究室のポスドクであるボブ・ハースバッハと、私たちの研究室の技術支援であるタチアナ・サイモンによって行われます。まず、安楽死させたマウスの胴体を35ミリメートルのペトリ皿に入れ、氷の上に置きます。ハサミで皮膚を開き、小さなハサミで椎骨を取り除きます。
次に、脊髄を抽出し、氷上の解剖バッファーに入れます。倍率2倍の定位解剖顕微鏡で、鉗子を用いて単離した脊髄から髄膜を除去し、解剖して洗浄した脊髄組織をCチューブに移した。神経組織解離キットから50マイクロリットルの酵素Pと、事前に調製した酵素ミックス30マイクロリットルを各Cチューブに加えます。
Cチューブを反転させ、加熱された解離した上に置き、すべての組織がチューブの蓋に集められるようにします。800マイクロリットルのアストロサイト培養培地を添加してカラムをセパレータから取り外し、付属のプランジャーで細胞をカラムから押し出すことにより、細胞を逃がします。予め調製した培養フラスコ中の平板細胞に、1ミリリットル当たり10ナノグラムのEGFおよびbFGFを添加した4.2ミリリットルのアストロサイト培養培地を添加する。
他の脳領域から単離された星状細胞のために培養フラスコをコーティングする必要はありませんが、脊髄から単離された星状細胞のためのより良い基質を提供します。摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞を培養します。安全レベル1の生物学的安全キャビネットの下でアストロサイトの着座を行い、テキスト原稿に記載されているように、Poly-D-リジンコーティングされたガラスカバースリップで24ウェルプレートを準備します。
プレーティングのために、P2マウスから6つの脊髄を単離すると、約100万個の細胞が得られます。培養したアストロサイトを含むT-12.5培養フラスコから培地を吸引し、1x PBSで1回洗浄します。0.5ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを加えてアストロサイトを培養フラスコから剥離し、摂氏37度で5分間インキュベートします。
フラスコの側面を軽くたたいて培養フラスコ表面から細胞を放出し、倍率10倍の明視野顕微鏡で剥離を確認します。2.5ミリリットルの星状細胞培養液でトリプシン化を停止し、15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を採取します。摂氏4度で5分間300RCFで遠心分離します。
上清を吸引し、1ミリリットルのアストロサイト培養液に細胞を再送する。血球計算盤または自動細胞計数システムを使用して細胞濃度を計算します。細胞数に基づいて、EGFおよびbFGFを添加した新鮮な星状細胞培地で細胞懸濁液を1因子当たり1ミリリットル当たり10ナノグラムで希釈する。
500マイクロリットルの細胞懸濁液を、予め調製した24ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cおよび5%二酸化炭素で細胞を培養する。49ミリリットルの塩基性培養培地に1ミリリットルのB27サプリメントを加えて、神経分化培地を調製します。24〜48時間後、細胞が形質導入されたか形質導入されたかに応じて、アストロサイト培地を1ウェルあたり1ミリリットルのニューロン分化培地と交換します。
9%二酸化炭素で摂氏37度で細胞を培養します。再プログラミング効率を高めるには、アストロサイト培地を分化培地に置き換えるときに、ニューロン分化培地にフォルスコリンとドルソモルフィンをそれぞれ最終濃度30マイクロモルと1マイクロモルまで補充します。細胞をフォルスコリンとドルソモルフィンで処理することを選択した場合は、最初の治療の2日後に2回目の投与のドルソモルフィンを提供します。
この2番目の処理を培地に直接加えます。アストロサイトの初代培養は、磁気支援細胞ソーティングおよびプレーティング後7〜10日で80〜90%のコンフルエンシーに達しました。メッキの翌日、セルは通常、カバースリップ表面の50〜60%を覆っていました。
この段階では、培養物は主に星状細胞で構成されていましたが、神経芽細胞などの他の細胞型は事実上存在しませんでした。形質導入またはトランスフェクションの7日後に、誘導された神経細胞は星状細胞と明確に区別できました。ニューロン細胞ソーマは、再プログラムされていないアストロサイトよりも小さく、長い突起があり、ニューロンマーカー、ベータ3チューブリン、アストロサイトマーカーGFAPに対して陰性でした。
形質導入またはトランスフェクション後21日目に、多くの誘導ニューロンは活動電位を発火させることができ、成熟ニューロンマーカーNeuNおよび汎シナプスタンパク質シナプトフィジンに対して陽性であった。関心領域を適切に分析することが不可欠です。周囲の組織からの汚染を避けます。
髄膜と背根神経節を孤立した脊髄から取り除くように注意する必要があります。この方法は、大脳皮質、背側中脳、小脳など、中枢神経系のさまざまな領域から星状細胞を分離するために使用できます。将来的には、この技術により、局所アストロサイトとその機能ニューロンへの再プログラムの可能性に関する知識を広げることができます。
