Целью данного протокола является обнаружение фенольных метаболитов в плазме полуцелевым методом UPLC-MS/MS. Белки плазмы осаждали этанолом и концентрировали образцы и повторно суспендировали в подвижной фазе перед инъекцией в оборудование UPLC. Соединения были идентифицированы с использованием полуцелевой библиотеки, собранной в лаборатории, с использованием менеджера PCDL для метаболомики, программного обеспечения и различных бесплатных онлайн-баз данных.
Мы осуществили питательное вмешательство с кексом и напитком из муки из семян брозимума аликаструма. В конце вмешательства улучшился питательный и саркопенический статус участников, а общее фенольное содержание плазмы было повышено. Но нам нужно определить, какие фенольные соединения были поглощены и внесли положительный эффект.
Идентификация и количественная оценка фенольных соединений, которые всасываются после потребления продуктов, богатых этими антиоксидантами, является сложной задачей, но необходимой, если необходимо продемонстрировать биологическую активность этих фитохимических веществ. Биодоступность большинства фенольных компонентов низкая, причем менее 5% из них поступают без структурного превращения в плазму. Большинство из них проходят через несколько биотрансформаций, таких как метилирование, сульфирование или глюкуронизация.
Широкий спектр исследований выявил наиболее распространенные метаболиты в биожидкостях ПО UPLC-MS и UPLC-MS/MS. Однако большая часть метаболита бактерий не сообщается об отсутствии баз данных, содержащих их полную информацию. Идентификация метаболитов осложняется стоимостью и коммерческой доступностью стандартов метаболитов.
Поэтому лучшей стратегией может быть нецелевой или полуцелевой анализ метаболитов MS/MS. Этот анализ основан на использовании информации о молекулярных признаках, соотношении массы к заряду моноизотопной точной массы, изотопном распределении и структуре фрагментации. Определить химическую идентичность и сравнить ее с бесплатно доступными онлайн-базами данных, которые содержат полифенольные метаболиты, идентифицированные в биожидкостях после потребления богатых полифенолами диет.
В настоящем исследовании мы разработали полуцелевой метод UPLC-MS / MS для анализа образцов плазмы группы пожилых людей, участвующих в пищевом вмешательстве. Храните образцы плазмы при температуре минус 80 градусов Цельсия до анализа. Размораживание образцов плазмы при комнатной температуре в течение 15 минут или при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Поместите 200 микролитров образца плазмы в двухмиллиметровую микропробирку и смешайте с 1000 микролитрами чистого этанола. Вихревой образец плазмы в течение 30 секунд. Образец центрифуги при 6, 580 центробежной силе в течение пяти минут.
После центрифугирования соберите супернатант с помощью микропипетки или пипетки Пастера и поместите его в новую микропробирку. Зарезервируйте супернатант. Смешайте гранулу с 1000 микролитрами чистого этанола, вершину в течение 30 секунд, а затем центрифугу в тех же условиях.
Соберите супернатант и смешайте с первым супернатантом. Удалите этанол из образца, используя чистый азот при 135 фунтах на квадратный дюйм. Держите иглу на расстоянии одного сантиметра от верхней части микропробирки, чтобы предотвратить потерю образца и промывку, пока образец не высохнет.
Повторное суспендирование сухих образцов в 100 микролитрах одного представляет собой одну смесь ацетонитрила с водой. Фильтр через 45-микронейлоновую шприцевую мембрану непосредственно в микровставку для флакона ВЭЖХ Введите три микролитра образца на UPLC, оснащенный реверсивной колонной C 18. Установите температуру автопробоотборника на 20 градусов Цельсия, а столбчатого термостата на 25 градусов Цельсия.
Вводите каждый образец в трех экземплярах. Используйте 0,1% муравьиной кислоты в воде в качестве растворителя А и 100% ацетонитрила в качестве растворителя B.Установите скорость потока на уровне 0,4 миллиметра в минуту и градиентную программу следующим образом: от нуля до одной минуты 10%B, от одной до четырех минут 30% B, от четырех до шести минут 38% B, от шести до восьми минут 60% B, от восьми до 8,5 минут 60% B, От 8,5 до девяти минут 10%В. Установите масс-спектрометр в отрицательный режим ионизации.
Используйте азот в качестве сушильного газа при 300 градусах Цельсия и скорости потока при 13 литрах в минуту. Установите давление небулайзера на уровне 30 фунтов на квадратный дюйм. Установите капиллярное напряжение на 4 000 вольт, фрагменторное напряжение на 175 вольт и напряжение скиммера на 65 вольт.
Сканируйте массы от 100 до 1100 м/з и для масс-спектрометрии сканируйте массы от 50 до 1000 м/з. Переведите сбор данных в режим Auto MS/MS. Используйте следующую ссылочную массу: 119.036 и 966.0007.
Поиск фенольных соединений, фенольных метаболитов и других соединений, представляющих интерес в научной литературе. Откройте программное обеспечение для управления базами данных, входящее в систему UPLC. Выберите файл, затем выберите новую составную библиотеку личной базы данных, PCDL.
Затем выберите, создайте новый PCDL. Выберите тип метаболомики PCDL LC/MS. Задайте имя для PCDL.
Затем выберите Создать. На панели инструментов выберите PCDL, а затем параметр Разрешить редактирование. Затем нажмите кнопку найти соединения.
Соединения могут быть добавлены в персональную библиотеку двумя способами, во-первых, путем копирования их из общей библиотеки прибора. Для этого откройте инструменты существующей базы данных, включенные в управление данными до сих пор. Нажмите кнопку найти соединения.
В одном варианте поиска введите составные критерии поиска, чтобы найти интересующее соединение. В таблице составных результатов выберите процентное соединение. Чтобы выбрать несколько соединений, щелкните первое соединение, удерживайте нажатой клавишу CTRL и щелкните каждое интересующее соединение.
Затем щелкните правой кнопкой мыши на всех выделенных соединениях и выберите Добавить в PCDL. В новом окне найдите и выберите специализированный файл персональной базы данных. Отметьте коробку, содержащую спектры для соединения, если оно присутствует.
Нажмите кнопку Добавить. В новом диалоговом окне выберите Да, чтобы проверить добавленные новые соединения. Выберите Нет, чтобы продолжить поиск интересующих соединений.
Во-вторых, новые соединения могут быть добавлены вручную, если они недоступны в общей библиотеке прибора. Для этого открыта специализированная персональная база данных. После открытия выберите PCDL, а затем параметр Разрешить редактирование.
Выберите параметр редактирования соединений. Нажмите кнопку добавить новый. В верхней части окна заполните информацию о новом соединении.
Введите формулу, имя, имя IUPAC, номер CAS, идентификатор Chemspider и другие идентификаторы. Используя информацию, доступную в бесплатных онлайн-библиотеках, Chemspider, PubChem и Phenol Explorer, чтобы заполнить информацию о новом интересующем соединении. После завершения нажмите кнопку сохранить как новую, чтобы сохранить новую составную информацию в специализированной персональной базе данных.
Повторите процесс со всеми интересующими соединениями, чтобы заполнить специализированную персональную базу данных. Используйте качественное управляющее программное обеспечение прибора для идентификации фенольных соединений и фенольных метаболитов. Откройте пример файла.
На панели «Хроматограмма» выберите «Определить хроматограммы» и извлечь общую ионную хроматограмму TIC, извлеченную ионно-хроматограмму MS EIC и EIC MS/MS. Выберите опцию интегрировать хроматограмму. На панели «Найти соединения» выберите «Найти по параметрам формулы».
В новом окне выберите источник формул, а затем параметр библиотеки косой черты базы данных. Найдите ранее созданную базу персональных данных и нажмите на кнопку открыть. Выберите параметр сопоставления формул и установите допуск на массовое совпадение в пять частей на миллион, ppm.
Выберите параметр отрицательных ионов и выберите только диалоговое окно минус H. В параметре «Результаты» отметьте извлечение EIC, извлеките очищенный спектр, извлеките необработанный спектр и включите структурированные диалоговые окна. Выберите параметр фильтров результатов.
А затем отметьте, предупреждайте, если оценка есть, затем установите совпадение баллов на 80%Затем отметьте не совпадать, если оценка есть, и установите оценку на 75% Затем нажмите на найти соединения по формуле, чтобы определить соединения, представляющие интерес в образце. Пошаговый процесс идентификации фенольных метаболитов с помощью полуцелевого анализа ОБРАЗЦОВ плазмы UPLC MS/MS показан на следующем рисунке. Во-первых, общая ионо-хроматограмма была получена с использованием самостоятельно созданной базы данных PCDL, содержащей 645 фенольных соединений и их метаболитов, полученных из бесплатных онлайн-баз данных.
Далее была получена извлеченная ионно-хроматограмма и рисунок фрагментации, или ионы с массой менее пяти ppm, допуск на соответствие. Наконец, изотопное распределение обнаруженных пиков сравнивали с теоретическим распределением соединений. Из этого анализа в образцах плазмы было идентифицировано в общей сложности 25 фенольных соединений и метаболитов.
Для оценки эффективности конструкционного метода в идентификации абсорбирующих фенольных соединений или их метаболитов были проанализированы пять образцов участников исследования, полученных до и после 30-дневного вмешательства. Относительное содержание каждого соединения рассчитывали путем деления площади под кривой после обработки на AUC до обработки. В таблице четвертой приведен список из 12 фенольных соединений, которые показали увеличение плазмы после 30-дневного потребления булочки, содержащей брозимум аликастр, содержащей продукты.
Фенилуксусная кислота была только метаболитом, обнаруженным последовательно в более высокой концентрации после лечения. Глицитин, гликозилированный изофлавон и три гидроксифенилвалеровые кислоты увеличились в трех из пяти образцов, но уменьшились в двух других. Гомисин М2, лигнан, был обнаружен в трех из пяти образцов только после вмешательства в питание.
Другие фенольные соединения и метаболиты были обнаружены только в одном образце и только после лечения. Метод, разработанный настоящей работой, показывает, что в большинстве своем он хорошо подходил для той цели, для которой он был создан. Образец на одно лечение был простым и эффективным.
Было достигнуто разделение UPLC и полуцелевая идентификация МС/МС фенольных метаболитов.
