L’objectif de ce protocole est de détecter les métabolites phénoliques dans le plasma par une méthode UPLC-MS/MS semi-ciblée. Les protéines plasmatiques ont été précipitées avec de l’éthanol et des échantillons concentrés, et remises en suspension dans la phase mobile, avant l’injection dans l’équipement UPLC. Les composés ont été identifiés à l’aide d’une bibliothèque semi-ciblée assemblée en laboratoire, en utilisant le gestionnaire PCDL pour la métabolomique, des logiciels et différentes bases de données en ligne gratuites.
Nous avons mis en place une intervention nutritionnelle avec un muffin et une boisson avec de la farine de graines de brosimum alicastrum. À la fin de l’intervention, l’état nutritionnel et sarcopénique des participants a été amélioré et la teneur totale en phénol du plasma a été augmentée. Mais nous devons identifier quels composés phénoliques ont été absorbés et ont contribué à l’effet positif.
L’identification et la quantification des composés phénoliques qui sont absorbés après la consommation d’aliments riches en ces antioxydants est une tâche difficile mais nécessaire, si l’on veut démontrer l’activité biologique de ces composés phytochimiques. La biodisponibilité de la plupart des composants phénoliques est faible, de plus moins de 5% d’entre eux entrent sans transformation structurelle en plasma. La plupart passent par plusieurs biotransformations, telles que la méthylation, la sulfonation ou la glucuronidation.
Un large éventail d’études ont identifié les métabolites les plus courants dans les biofluides par UPLC-MS et UPLC-MS/MS. Cependant, une grande partie du métabolite bactérien n’est pas signalée au manque de bases de données contenant leurs informations complètes. L’identification des métabolites est compliquée par le coût et la disponibilité commerciale des étalons de métabolites.
Par conséquent, la meilleure stratégie peut être l’analyse non ciblée ou semi-ciblée des métabolites de la SEP/SEP. Cette analyse repose sur l’utilisation d’informations sur les caractéristiques moléculaires, le rapport masse/charge de la masse exacte monoisotopique, la distribution isotopique et le modèle de fragmentation. Déterminer l’identité chimique et la comparer avec les bases de données en ligne disponibles gratuitement qui contiennent des métabolites polyphénoliques identifiés dans les biofluides après la consommation de régimes riches en polyphénols.
Dans la présente étude, nous avons mis au point une méthode semi-ciblée UPLC-MS/MS pour analyser les échantillons de plasma d’un groupe de personnes âgées impliquées dans une intervention nutritionnelle. Conservez les échantillons de plasma à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Décongeler les échantillons de plasma à température ambiante pendant 15 minutes ou à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Placer 200 microlitres d’échantillon de plasma dans un microtube de deux millimètres et mélanger avec 1000 microlitres d’éthanol pur. Échantillon de plasma Vortex pendant 30 secondes. Échantillon de centrifugeuse à 6 580 de force centrifuge pendant cinq minutes.
Après centrifugation, recueillir le surnageant avec une micropipette ou une pipette Pasteur et le placer dans un nouveau microtube. Réservez le surnageant. Mélanger une pastille avec de l’éthanol pur de 1000 microlitres, vertex pendant 30 secondes, puis centrifuger dans les mêmes conditions.
Recueillir le surnageant et mélanger avec le premier surnageant. Retirer l’éthanol de l’échantillon en utilisant de l’azote pur à 135 psi. Gardez l’aiguille à un centimètre du sommet du microtube pour éviter la perte d’échantillon et rincez jusqu’à ce qu’un échantillon soit sec.
Remettre en suspension des échantillons secs dans 100 microlitres d’un mélange d’acétonitrile avec de l’eau. Filtrer à travers une membrane de seringue en nylon de 45 micro directement dans un micro-insert de flacon HPLC Injecter trois microlitres d’échantillon sur UPLC équipé d’une colonne de phase inverse C 18. Réglez la température de l’échantillonneur automatique à 20 degrés Celsius et le thermostat à colonne à 25 degrés Celsius.
Injecter chaque échantillon en trois exemplaires. Utiliser 0,1% d’acide formique dans l’eau comme solvant A et 100% d’acétonitrile comme solvant B.Réglez le débit à 0,4 millimètre par minute et un programme de gradient comme suit, de zéro à une minute 10% B, une à quatre minutes 30% B, quatre à six minutes 38% B, six à huit minutes 60% B, huit à 8,5 minutes 60% B, 8,5 à neuf minutes 10%B. Réglez le spectromètre de masse en mode d’ionisation négative.
Utilisez l’azote comme gaz de séchage à 300 degrés Celsius et le débit à 13 litres par minute. Réglez la pression du nébuliseur à 30 psi. Réglez une tension capillaire à 4 000 volts, une tension fragmentaire à 175 volts et une tension Skimmer à 65 volts.
Scannez les masses entre 100 et 1100 m/z et pour la spectrométrie de masse, scannez les masses entre 50 et 1000 m/z. Réglez l’acquisition de données en mode Auto MS/MS. Utilisez la masse de référence suivante, 119.036 et 966.0007.
Recherche de composés phénoliques, de métabolites phénoliques et d’autres composés d’intérêt dans la littérature scientifique. Ouvrez le logiciel de gestion de base de données inclus dans le système UPLC. Sélectionnez fichier, puis sélectionnez une nouvelle bibliothèque composée de base de données personnelle, PCDL.
Sélectionnez ensuite, créez un nouveau PCDL. Sélectionnez le type de métabolomique PCDL LC/MS. Définissez le nom de PCDL.
Sélectionnez ensuite créer. Dans la barre d’outils, sélectionnez PCDL, puis l’option Autoriser l’édition. Cliquez ensuite sur le bouton Rechercher des composés.
Les composés peuvent être ajoutés à la bibliothèque personnelle de deux façons, d’abord en les copiant à partir de la bibliothèque générale de l’instrument. Pour ce faire, ouvrez la base de données existante des instruments inclus dans la gestion des données jusqu’à présent. Cliquez sur le bouton Rechercher des composés.
Dans l’option de recherche unique, entrez les critères de recherche composés pour trouver le composé d’intérêt. Dans le tableau des résultats composés, sélectionnez le composé d’intérêt. Pour sélectionner plusieurs composés, cliquez sur le premier composé, puis maintenez la touche CTRL enfoncée, puis cliquez sur chaque composé d’intérêt.
Ensuite, faites un clic droit sur tous les composés en surbrillance et sélectionnez Ajouter à PCDL. Dans la nouvelle fenêtre, recherchez et sélectionnez le fichier de base de données personnel spécialisé. Cochez la case inclure les spectres pour le composé s’il est présent.
Cliquez sur le bouton Ajouter. Dans la nouvelle boîte de dialogue, sélectionnez Oui pour vérifier les nouveaux composés ajoutés. Sélectionnez Non pour continuer à rechercher d’autres composés d’intérêt.
Deuxièmement, de nouveaux composés peuvent être ajoutés manuellement s’ils ne sont pas disponibles dans la bibliothèque générale de l’instrument. Pour cela ouvert, la base de données personnelle spécialisée. Une fois ouvert, sélectionnez PCDL, puis l’option Autoriser l’édition.
Sélectionnez l’option Modifier les composés. Cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau. Dans la partie supérieure de la fenêtre, complétez les informations du nouveau composé.
Remplissez la formule, le nom, le nom IUPAC, le numéro CAS, l’ID Chemspider et d’autres identificateurs. En utilisant les informations disponibles dans les bibliothèques en ligne gratuites, Chemspider, PubChem et Phenol Explorer pour remplir les informations du nouveau composé d’intérêt. Une fois terminé, cliquez sur le bouton Enregistrer comme neuf pour enregistrer les nouvelles informations composées dans la base de données personnelle spécialisée.
Répétez le processus avec tous les composés d’intérêt pour compléter la base de données personnelle spécialisée. Utilisez le logiciel de gestion qualitative de l’instrument pour identifier les composés phénoliques et les métabolites phénoliques. Ouvrez le fichier d’exemple.
Dans le panneau Chromatogramme, sélectionnez Définir les chromatogrammes et extraire le chromatogramme ionique total TIC, le chromatogramme ionique extrait de MS EIC et l’EIC de MS/MS. Sélectionnez l’option Intégrer le chromatogramme. Dans le panneau Rechercher des composés, sélectionnez les options Rechercher par formule.
Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez la source de formule, puis l’option bibliothèque de barres obliques de base de données. Trouvez la base de données personnelle précédemment créée et cliquez sur ouvrir. Sélectionnez l’option de correspondance de formule et définissez une tolérance de correspondance de masse de cinq parties par million, ppm.
Sélectionnez l’option ions négatifs et sélectionnez uniquement la boîte de dialogue moins H. Dans l’option résultats, marquez l’EIC d’extraction, extrayez le spectre nettoyé, extrayez le spectre brut et incluez des boîtes de dialogue structurées. Sélectionnez l’option filtres de résultats.
Et puis marquez avertir si le score est, puis définissez la correspondance de score à 80%Puis marque ne correspondez pas si le score est et définissez le score à 75%Puis cliquez sur la recherche de composés par formule pour identifier les composés d’intérêt dans l’échantillon. Le processus étape par étape pour l’identification des métabolites phénoliques par l’analyse semi-ciblée UPLC MS/MS des échantillons de plasma est illustré dans la figure suivante. Tout d’abord, le chromatogramme ionique total a été obtenu à l’aide d’une base de données PCDL auto-créée qui contenait 645 composés phénoliques et leurs métabolites, obtenus à partir de bases de données en ligne gratuites.
Ensuite, le chromatogramme ionique extrait et le motif de fragmentation, ou les ions de masse inférieure à cinq ppm, correspondent à la tolérance ont été obtenus. Enfin, la distribution isotopique des pics détectés a été comparée à celle des composés théoriques. À partir de cette analyse, un total de 25 composés phénoliques et métabolites ont été identifiés dans les échantillons de plasma.
Pour évaluer l’efficacité de la méthode de conception dans l’identification des composés phénoliques absorbants ou de leurs métabolites, cinq échantillons des participants à l’étude obtenus avant et après l’intervention de 30 jours ont été analysés. L’abondance relative de chaque composé a été calculée en divisant l’aire sous la courbe après traitement par ASC avant traitement. Le tableau quatre montre la liste des 12 composés phénoliques qui ont montré une augmentation du plasma après la consommation de 30 jours de la farine de brosimum alicastrum contenant des aliments.
L’acide phénylacétique n’a été trouvé que comme métabolite systématiquement à une concentration plus élevée après le traitement. La glycitine, une isoflavone glycosylée et trois acides hydroxyphénylvalériques ont augmenté dans trois des cinq échantillons, mais ont diminué dans les deux autres. La gomisine M2, un lignan, n’a été détectée dans trois des cinq échantillons qu’après l’intervention nutritionnelle.
Les autres composés phénoliques et métabolites n’ont été trouvés que dans un seul échantillon et seulement après le traitement. La méthode développée dans le présent document montre que, dans la plupart des cas, elle était bien adaptée à l’objectif pour lequel elle a été créée. L’échantillon par traitement était simple et efficace.
La séparation upLC et l’identification semi-ciblée des métabolites phénoliques de la SEP/SEP ont été réalisées.
