Этот метод полезен при определении клеточной энергетики, такой как скорость производства АТФ, а также для определения клеточного предпочтения по отношению к конкретному метаболиту в режиме реального времени. Для начала добавьте 200 микролитров калибранта XF и высиживайте полезную пластину в течение не менее одного часа перед анализом. Подготовьте 80 миллилитров среды для анализа XF с использованием дополненного XF DMEM.
Разморозьте олигомицин А, ротенон и антимицин А на льду. Пипетка соединений вверх и вниз, чтобы солюбилизировать их перед использованием. Добавьте три миллилитра подготовленной пробирной среды в каждую трубку, меченую буквами А и В.Добавьте 26,4 микролитра 2,5 миллимолярного олигомицина А в трубку А и 3,1 микролитра 12,67 миллимолярного ротенона, 4,1 микролитра 9,4 миллимолярного антимицина А и 30 микролитров пятна Хука в трубку B.Загрузите 10-кратную концентрацию этих ингибиторов в соответствующий инъекционный порт.
И, наконец, 20 микролитров этих соединений будут загружены в ячейки в 200 микролитрах пробирной среды. Извлеките микропластинку клеточной культуры из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия и понаблюдайте за клетками под микроскопом. Снимите пробирную среду с водяной бани.
Аккуратно промыть клетки 200 микролитрами предварительно подогретой пробирной среды дважды и добавить 200 микролитров пробирной среды на лунку. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки остаются прикрепленными к лункам. Убедитесь, что ячейки в скважинах D5 и E8 прикреплены к последовательному монослою и не были смыты на этапе промывки.
Программное обеспечение для визуализации клеток использует эти две скважины для настройки автофокуса и автоматической экспозиции. Откройте настольное программное обеспечение на компьютере рядом с оборудованием. Проверьте состояние подключения в левом нижнем углу программного обеспечения контроллера.
Перейдите в раздел Шаблоны и выберите шаблон анализа скорости XF ATP или соответствующий шаблон анализа. Выберите Определения групп в верхней части экрана и определите группы. выбрать макет карты плит и назначить скважины в зависимости от определенных групп.
Проверьте протокол прибора. Убедитесь, что добавленные соединения правильно перечислены и включите информацию о проекте для будущих ссылок. Нажмите на Run Assay.
Это приведет к выбору места хранения результирующего файла. Выберите расположение для сохранения результирующего файла. Сохраните файл с датой анализа и нажмите «Начать запуск».
Поместите картридж датчика и пластину утилиты на лоток и нажмите «Я готов начать калибровку». Откройте программное обеспечение для визуализации клеток на компьютере. Убедитесь, что тепловизор микропластин включен и порты подключены к компьютеру.
Проверьте строку состояния в левом нижнем углу экрана, чтобы убедиться, что температура установлена на 37 градусов по Цельсию и что состояние подключения должно быть выделено зеленым цветом как готовое. Отсканируйте штрих-код пластины, чтобы начать процесс визуализации. Укажите имя ячейки и нажмите Кнопку Сохранить.
Здесь будут сохранены яркие и флуоресцентные изображения. Нажмите «Выполнить сканирование Brightfield» и на следующем экране «Пластина и меню сканирования» отобразят параметры визуализации. Перед анализом выберите Начать сканирование Brightfield.
Поместите микропластинку клеточной культуры и крышку пластины на держатель лотка и выровняйте колодец A1 с маркировкой A1. Нажмите закрыть лоток. Получение изображения Brightfield появляется на следующем экране с картой пластин.
Нажмите «Сканировать все скважины» и сканируйте в течение 30-35 минут. По завершении калибровки программное обеспечение отображает диалоговое окно Load Cell Plate. Затем нажмите «Открыть лоток», чтобы заменить лоток утилиты микропластинкой клеточной культуры.
Обратите внимание, что пластина для культивирования клеток находится в тепловизоре микропластины. После сканирования извлеките микропластинку клеточной культуры и поместите ее в анализатор для выполнения анализа. Затем нажмите на пластину тензодатчика, чтобы начать анализ.
Дождитесь начала анализа и отобразите предполагаемое время завершения. По завершении анализа программное обеспечение отображает диалоговое окно «Выгрузить картридж датчика» и «Ячейка пластины». Нажмите кнопку Извлечь и извлеките микропластинку клеточной культуры из анализатора.
Осторожно снимите картридж датчика и замените крышку пластины ячейки. Появится диалоговое окно Проверка завершена. Затем нажмите «Просмотреть результаты», чтобы открыть файл результатов анализа или нормализовать данные.
После завершения анализа отсканируйте штрих-код пластины с помощью портативного считывателя штрих-кодов. Если пластина уже была изображена, она не потребует нового имени. Выберите Флуоресценция и количество клеток.
Поместите ячейку на держатель лотка и нажмите «Закрыть лоток». В окне получения изображения выберите Сканировать все скважины, чтобы начать визуализацию. Просмотрите флуоресцентные изображения и количество клеток в приложении визуализации и визуализации клеток, случайным образом щелкнув по паре лунок.
После завершения флуоресцентной визуализации экспортируйте изображения для получения дополнительных ссылок. После завершения обработки изображений и подсчета ячеек откройте файл результатов и нажмите «Нормализовать». Нажмите «Импорт» и выберите «Применить для настольного программного обеспечения», чтобы автоматически нормализовать анализ с количеством ячеек.
Инъекция смеси олигомицина А и FCCP повышала базовую активность контрольной группы. Стрессоры показали значительно высокий уровень энергии в контрольной и лечебной одной группе. С другой стороны, лечение двух имело сравнительно более низкую базовую активность, и клетки стали более аэробными.
Рисунок показывает, что как контрольные, так и экспериментальные клетки используют гликолиз и митохондриальное окислительное фосфорилирование для генерации АТФ. Экспериментальная группа демонстрирует снижение генерации АТФ посредством гликолиза и увеличение митохондриального дыхания. Частота базального дыхания в группе лечения сравнительно меньше, чем в контрольной группе.
Дыхание и скорость производства АТФ в обеих группах снижаются вместе с утечкой протонов с последующей инъекцией олигомицина А. Частота дыхания клеток снова повышается до максимального дыхания после инъекции FCCP. Заключительная инъекция ротенона и антимицина А снова снижает OCR.
После третьей инъекции митохондриальное дыхание отключается комбинацией ротенона и антимицина А. По сравнению с контрольной группой базальное и максимальное дыхание групп лечения относительно не изменяется. Рисунок показывает, что контрольная группа сильно зависит от пути глюкозы, в то время как окисление глютамина было эффективным в контрольной группе. Путь жирных кислот показывает, что лечение увеличило общую емкость клеток.
Наличие нескольких инъекционных портов на кислотной пластине помогает нам определить влияние нескольких лекарств на клеточную энергетику в один момент времени.
