هذه الطريقة مفيدة في تحديد الطاقة الخلوية ، مثل معدل إنتاج ATP ، وكذلك لتحديد التفضيل الخلوي تجاه مستقلب معين في الوقت الفعلي. للبدء، أضف 200 ميكرولتر من عيار XF واحتضن لوحة المرافق لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الفحص. قم بإعداد 80 ملليلتر من وسائط فحص XF باستخدام XF DMEM المكمل.
إذابة الأوليغوميسين A والروتينون ومضاد المايسين A على الجليد. ماصة المركبات صعودا وهبوطا للذوبان فيها قبل الاستخدام. أضف ثلاثة ملليلترات من وسط الفحص المحضر إلى كل أنبوب ، المسمى A و B.أضف 26.4 ميكرولتر من 2.5 ملليمولار أوليغوميسين A إلى الأنبوب A و 3.1 ميكرولتر من 12.67 ملليمولار روتينون ، و 4.1 ميكرولتر من 9.4 ملليمولار مضاد للمايسين A ، و 30 ميكرولتر وصمة هوك في الأنبوب B.قم بتحميل تركيز 10x من هذه المثبطات في منفذ الحقن المقابل.
وأخيرا ، سيتم تحميل 20 ميكرولتر من هذه المركبات في الخلايا في 200 ميكرولتر من وسائط الفحص. قم بإزالة الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا من الحاضنة 37 درجة مئوية وراقب الخلايا تحت المجهر. قم بإزالة وسيط الفحص من الحمام المائي.
اغسل الخلايا بلطف باستخدام 200 ميكرولتر من متوسط الفحص المسخن مسبقا مرتين ، وأضف 200 ميكرولتر من وسائط الفحص لكل بئر. تحقق من الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا تظل ملتصقة بالآبار. تأكد من أن الخلايا الموجودة في الآبار D5 و E8 ملتصقة بطبقة أحادية ثابتة ولم يتم غسلها أثناء خطوة الغسيل.
يستخدم برنامج التصوير الخلوي هذين البئرين لضبط التركيز التلقائي والتعرض التلقائي. افتح برنامج سطح المكتب في الكمبيوتر بجوار الجهاز. تحقق من حالة الاتصال في الزاوية السفلية اليسرى من برنامج وحدة التحكم.
انتقل إلى القوالب وحدد قالب فحص معدل XF ATP أو قالب الفحص المناسب. حدد تعريفات المجموعة في أعلى الشاشة وحدد المجموعات. حدد تخطيط خريطة اللوحة وقم بتعيين الآبار اعتمادا على المجموعات المحددة.
تحقق من بروتوكول الصك. تأكد من إدراج المركبات المضافة بشكل صحيح وتضمين معلومات المشروع للمراجع المستقبلية. انقر فوق تشغيل الفحص.
سيؤدي ذلك إلى المطالبة بتحديد موقع تخزين ملف النتيجة. حدد الموقع لحفظ ملف النتيجة. احفظ الملف بتاريخ الفحص وانقر فوق بدء التشغيل.
ضع خرطوشة المستشعر ولوحة الأداة المساعدة على الدرج وانقر فوق "أنا مستعد لبدء المعايرة". افتح برنامج تصوير الخلايا على الكمبيوتر. تأكد من تشغيل جهاز تصوير اللوحة الدقيقة وتوصيل المنافذ بالكمبيوتر.
تحقق من شريط الحالة في أسفل يسار الشاشة للتأكد من ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وأنه يجب تمييز حالة الاتصال باللون الأخضر كجاهزة. امسح الرمز الشريطي للوحة لبدء عملية التصوير. أدخل اسما إلى لوحة الخلية واضغط على حفظ.
سيتم حفظ صور Brightfield والفلورسنت هنا. انقر فوق إجراء مسح Brightfield ، وفي الشاشة التالية ، تعرض قائمة اللوحة والمسح الضوئي خيارات التصوير. قبل الفحص، حدد بدء فحص برايتفيلد.
ضع الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا وغطاء اللوحة على حامل الدرج وقم بمحاذاة A1 جيدا مع علامة A1. انقر على إغلاق الدرج. يظهر الحصول على صورة Brightfield في الشاشة التالية مع خريطة لوحة.
انقر فوق مسح جميع الآبار والمسح الضوئي لمدة 30 إلى 35 دقيقة. عند الانتهاء من المعايرة ، يعرض البرنامج مربع حوار لوحة خلية التحميل. ثم انقر فوق فتح الدرج لاستبدال درج الأدوات المساعدة بلوحة صغيرة لزراعة الخلايا.
لاحظ أن لوحة زراعة الخلايا موجودة في جهاز تصوير الصفائح الدقيقة. بعد الفحص ، قم بإزالة الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا وضعها في المحلل لإجراء الفحص. ثم انقر فوق تحميل لوحة الخلية لبدء الفحص.
انتظر حتى يبدأ الفحص واعرض وقت الانتهاء المقدر. عند الانتهاء من الفحص ، يعرض البرنامج خرطوشة مستشعر التفريغ ومربع حوار لوحة الخلية. انقر فوق إخراج وإزالة microplate مزرعة الخلايا من المحلل.
قم بإزالة خرطوشة المستشعر بعناية واستبدل غطاء لوحة الخلية. يظهر مربع الحوار "إكمال المقايسة". ثم انقر فوق عرض النتائج لفتح ملف نتيجة الفحص أو لتطبيع البيانات.
بعد الانتهاء من الفحص ، امسح الرمز الشريطي للوحة باستخدام قارئ الباركود المحمول باليد. إذا تم تصوير اللوحة بالفعل ، فلن تتطلب اسما جديدا. حدد التألق وعدد الخلايا.
ضع لوحة الخلية على حامل الدرج وانقر على إغلاق الدرج. في نافذة الحصول على الصورة، حدد مسح جميع الآبار ضوئيا لبدء التصوير. راجع الصور الفلورية وعدد الخلايا في تطبيق التصوير وتصوير الخلايا عن طريق النقر عشوائيا على اثنين من الآبار.
بمجرد اكتمال التصوير الفلوري ، قم بتصدير الصور للحصول على مراجع إضافية. بمجرد اكتمال التصوير وعدد الخلايا ، افتح ملف النتائج وانقر فوق Normalize. انقر فوق استيراد وحدد تطبيق للحصول على برنامج سطح المكتب لتطبيع الفحص مع عدد الخلايا تلقائيا.
زاد حقن مزيج الإجهاد oligomycin A و FCCP من النشاط الأساسي لمجموعة التحكم. أظهرت الضغوطات مستوى طاقة مرتفعا بشكل ملحوظ في مجموعة التحكم والعلاج الواحدة. من ناحية أخرى ، كان للعلاج الثاني نشاط أساسي أقل نسبيا ، وأصبحت الخلايا أكثر هوائية.
يشير الشكل إلى أن الخلايا الضابطة والتجريبية تستخدم تحلل السكر والفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا لتوليد ATP. تظهر المجموعة التجريبية انخفاضا في توليد ATP عن طريق تحلل السكر وزيادة في تنفس الميتوكوندريا. معدل التنفس القاعدي في مجموعة العلاج أقل نسبيا من المجموعة الضابطة.
يتم تقليل معدلات إنتاج التنفس و ATP في كلتا المجموعتين ، إلى جانب تسرب البروتون متبوعا بحقن oligomycin A. ترتفع معدلات التنفس في الخلايا مرة أخرى إلى أقصى قدر من التنفس بعد حقن FCCP. الحقن النهائي للروتينون ومضاد المايسين A يقلل من التعرف الضوئي على الحروف مرة أخرى.
بعد الحقن الثالث ، يتم إيقاف التنفس الميتوكوندريا عن طريق الجمع بين الروتينون ومضاد المايسين A.بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، فإن التنفس القاعدي والحد الأقصى لمجموعات العلاج ليس له أي تغيير نسبيا. يوضح الشكل أن المجموعة الضابطة تعتمد بشكل كبير على مسار الجلوكوز ، في حين أن أكسدة الجلوتامين كانت فعالة في المجموعة الضابطة. يظهر مسار الأحماض الدهنية أن العلاج قد زاد من القدرة الإجمالية للخلايا.
يساعدنا توفر منافذ حقن متعددة على الصفيحة الحمضية على تحديد تأثير أدوية متعددة على الطاقة الخلوية في نقطة زمنية واحدة.
