3D-сфероиды опухолей заменили традиционную 2D-однослойную технику в качестве золотого стандарта для исследований рака in vitro. Эти модели позволяют проводить кокультуру нескольких типов клеток, которые отражают гетерогенность микроокружения опухоли и позволяют использовать пространственные взаимодействия. Преимуществами использования метода висячих капель для генерации 3D-сфероидов является отсутствие клеточно-пластического взаимодействия и легкость изучения взаимодействия между опухолевыми клетками и неопухолевыми клетками.
Этот метод также обеспечивает воспроизводимый и экономически эффективный способ моделирования опухолево-стромального взаимодействия. 3D-опухоли являются ценными доклиническими моделями и часто используются в качестве инструмента скрининга лекарств. Этот метод может быть применен для изучения фармакологического воздействия множественных соединений на рост опухоли и окружающую микросреду.
Процесс формирования сфероидов удобен для пользователя и требует обычного лабораторного оборудования для клеточных культур. Сфероиды могут быть изображены с помощью любого настольного инвертированного светового микроскопа, а анализ размера и формы сфероидов может быть выполнен с использованием широко доступного онлайн-программного обеспечения для анализа изображений. Для начала удалите линии опухолевых клеток Huh7 и Hep3B HCC и клеточные линии фибробластов COS-7 и LX2 из их хранилища в жидком азоте и быстро разморозьте их.
После размораживания разбавляют размороженные клетки двумя миллилитрами свежей питательной среды. Центрифугирование клеток. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте гранулу клетки в одном миллилитре свежей теплой питательной среды.
Затем засейте клетки в колбы для культивирования клеток T75 и инкубируйте их в инкубаторе клеточной культуры, пока клетки не достигнут 60-70+конфлюзии. Для сбора клеток аспирируйте культуральную среду и трижды промывайте клетки PBS. Затем, чтобы отсоединить адгезивные клетки от дна колб, добавляют два миллилитра предварительно нагретого трипсина и насиживают при 37 градусах Цельсия.
Через четыре минуты инактивируют трипсин, добавляя четыре миллилитра полной питательной среды и собирают клеточную суспензию, затем центрифугируют клетки и выбрасывают супернатант перед повторным использованием клеток в одном миллилитре свежей питательной среды. Наконец, добавьте еще три миллилитра свежей питательной среды. Чтобы подсчитать клетки, осторожно вихрьте клеточную суспензию.
Затем, используя 10-микролитровую пипетку, смешайте 10 микролитров клеточной суспензии с 10 микролитрами трипан-синего цвета и аккуратно пипеткой смесь вверх и вниз четыре раза, чтобы обеспечить полное окрашивание наружной поверхности клетки красителем. Затем поместите крышку над областью подсчета гемоцитометра. Затем поместите наконечник пипетки, содержащий смесь ячеек, рядом с краем крышки и осторожно вытолкните содержимое наконечника в счетный слайд.
Подождав несколько минут, пока суспензия осядет, зафиксируйте гемоцитометр на ступени микроскопа и подсчитайте клетки, перекрывающие верхнее или правое крыло, избегая тех, которые перекрывают нижнюю или левую границу. Наконец, вычислите общее количество ячеек с помощью этой формулы. После аспирации питательной среды промыть клетки LX2 три раза PBS.
Отсоедините клетки с помощью трипсина, как было продемонстрировано ранее, и центрифугируйте их. После подсчета клеток, как было показано ранее, посейте один раз от 10 до шести клеток LX2 в чашках объемом 10 кубических сантиметров и высиживайте при 37 градусах Цельсия. Через 48 часов соберите кондиционированную фибробластами среду и центрифугу, чтобы гранулировать любые плавающие клетки.
Фильтр стерилизует кондиционированную среду с помощью 0,22-микронного фильтра, прикрепленного к 20-миллилитровому шприцу. Затем аликвотирование среды в две миллилитровые трубки для хранения при минус 80 градусах Цельсия. Добавьте 10 миллилитров стерильного PBS на дно тарелки объемом 10 кубических сантиметров, чтобы обеспечить влажные условия для сфероидов.
Затем суспендировать 1 500 клеток HuH7 HCC с 1 500 клетками фибробластов млекопитающих COS-7 в висячих каплях для образования сфер. Переверните крышку тарелки, чтобы среда, включая клеточную суспензию, висела над влажной средой. Через три дня, чтобы сделать снимки сфероидов, поставьте тарелку на ступень перевернутого микроскопа и отрегулируйте увеличение в пять раз.
Затем откройте программное обеспечение микроскопа на подключенном компьютере и отрегулируйте его фокус, чтобы иметь четкое изображение каждого сфероида. Затем используйте инструмент snap на программном обеспечении микроскопа, чтобы получить изображения и сохранить полученные изображения. Добавьте 10 миллилитров стерильного PBS на дно тарелки объемом 10 кубических сантиметров.
Затем подвешивайте 3 000 клеток Hep3B HCC в подвесных каплях, чтобы сформировать сферы и перевернуть крышку чашки, позволяя каплям висеть над влажной средой в течение трех дней. Затем переведите сфероиды Hep3B в 20 микролитров свежих сред состояния из клеток LX2 в подвесных каплях. Затем переверните крышку тарелки, на которой образуются сфероиды, и закрепите крышку на сцене светового микроскопа.
Отрегулируйте тонкую фокусировку микроскопа, чтобы сделать каждый сфероид видимым, как было продемонстрировано ранее. После нажатия кнопки плунжера, чтобы осторожно опорожнить воздух из микропипетки, вставьте наконечник пипетки в каплю, содержащую сфероид, подлежащий переносу. Подойдите очень близко к сфероиду, не касаясь его наконечником.
Затем осторожно отпустите давление на кнопку плунжера, чтобы обеспечить всасывание сфероида в наконечник микропипетки в двух микролитрах среды. Затем переложите сфероид в новую каплю, висящую на новой тарелке объемом 10 кубических сантиметров. Делайте снимки сфероидов с пятикратным увеличением с помощью перевернутого микроскопа со дня переноса до седьмого дня культивирования в кондиционированной среде LX2.
Чтобы проанализировать изображения растущих сфероидов, откройте каждое изображение сфероида в программном обеспечении для анализа изображений и используйте инструмент выбора от руки, чтобы очертить каждый сфероид. Затем в раскрывающемся списке анализа выберите установить измерение, затем область и нажмите OK. Затем вручную нарисуйте круг вокруг каждого сфероида и, как только сфера обведется, нажмите Control M, чтобы программа могла рассчитать область сфероида в пикселях. Затем преобразуйте площадь сфероида в объем, используя эту формулу.
Наконец, рассчитайте изменение объема сфероида относительно его объема в первый день захвата изображения. Во время оптимизации плотности клеток для образования сфероидов более высокие плотности посева в 12 000 и 6 000 клеток дали сфероиды с асимметричной формой, в то время как плотность посева 3000 клеток дала идеальный округлый 3D-сфероид. Таким образом, 3000 сфероидов плотности клеток были адаптированы для дальнейших экспериментов.
Продольная оценка пролиферативного воздействия кокультурирующих опухолевых и фибробластных клеточных линий показала, что с четвертого дня гетеротипические сфероиды росли в идеальной круглой форме по сравнению с гомотипическими сфероидами. Гетеротипические сфероиды первоначально показали фазу быстрого роста, начиная с четвертого дня до седьмого дня, за которой следовала более медленная фаза на восьмой день. Затем объем сфероида уменьшался на девятом и 10-м днях, что, возможно, отражало истощение питательных веществ или гипоксическое ядро и гибель клеток.
Напротив, гомотипические сфероиды демонстрировали относительно статическую кривую роста до пятого дня, за которой следовало постепенное увеличение их кривых роста с шестого дня. Более высокая скорость роста гетеротипических сфероидов говорит о том, что прямой контакт между опухолью и фибробластами увеличивает размер сфероидов опухоли. Когда трехдневные гомотипические сфероиды Hep3B выращивались в свежих средах, клетки образовывали идеально округлые сфероиды через три дня и демонстрировали продолжение пролиферации до седьмого дня.
Скорость роста была увеличена, когда сфероиды поддерживались в кондиционированных средах LX2, что свидетельствует о пролиферации опухолевых сфероидов, вызванной фибробластами. Крайне важно убедиться, что стерильный BBS добавляется на дно посуды для поддержания подходящего влажного состояния для образования сфероидов. Кроме того, будьте осторожны при переворачивании крышки, чтобы сфероиды и капли не были нарушены.
3D-сфероиды опухолей могут быть зафиксированы или заморожены и сохранены для будущих применений, таких как иммунохимия или иммунофлуоресценция, а также экстракция РНК для транскриптомного анализа. Гетеротипические сфероиды с предварительно мечеными клетками могут быть визуализированы и отслежены, чтобы обеспечить понимание клеточно-клеточных взаимодействий в микроокружении опухоли.
