حلت كرويات الورم ثلاثية الأبعاد محل تقنية أحادية الطبقة التقليدية 2D كمعيار ذهبي لأبحاث السرطان في المختبر. تسمح هذه النماذج بالثقافة المشتركة لأنواع الخلايا المتعددة التي تعكس عدم تجانس البيئة الدقيقة للورم وتسمح باستغلال التفاعلات المكانية. مزايا استخدام طريقة قطرات معلقة لتوليد كرويدات 3D هو عدم وجود تفاعل بين الخلايا والبلاستيك وسهولة دراسة التفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا غير السرطانية.
توفر هذه التقنية أيضا طريقة قابلة للاستنساخ وفعالة من حيث التكلفة لنمذجة التفاعل بين الورم والستروم. الأورام ثلاثية الأبعاد هي نماذج قيمة قبل السريرية وغالبا ما تستخدم كأداة لفحص الأدوية. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة الآثار الدوائية لمركبات متعددة على نمو الورم والبيئة الدقيقة المحيطة به.
عملية تشكيل كروية سهلة الاستخدام وتتطلب معدات مختبر ثقافة الخلية التقليدية. يمكن تصوير كرويدات باستخدام أي مجهر ضوء مقلوب أعلى مقاعد البدلاء ، ويمكن إجراء تحليل حجم وشكل كروي باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة على الإنترنت على نطاق واسع. للبدء، قم بإزالة خطوط خلايا الورم Huh7 و Hep3B HCC وخطوط خلايا الخلايا الليفية COS-7 و LX2 من رف التخزين الخاص بها في النيتروجين السائل وإذابة الجليد بسرعة.
بعد إزالة الجليد، تمييع الخلايا المذابة مع اثنين من ملليلتر من وسط الثقافة الطازجة. طرد مركزي للخلايا. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من وسط الثقافة الدافئة الطازجة.
ثم بذر الخلايا في قوارير زراعة الخلايا T75 واحتضانها في حاضنة ثقافة الخلية حتى تصل الخلايا إلى 60 إلى 70&؛التقاء. لجمع الخلية، يستنشق وسائط الثقافة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. ثم لفصل الخلايا الملتصقة من أسفل القوارير، إضافة اثنين من ملليلتر من التربسين قبل الحارة واحتضان في 37 درجة مئوية.
بعد أربع دقائق، تعطيل التريبسين بإضافة أربعة ملليلترات من وسيط الثقافة الكاملة وجمع تعليق الخلية، ثم الطرد المركزي للخلايا والتخلص من supernatant قبل إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة. وأخيرا، أضف ثلاثة ملليلترات إضافية من وسيط الثقافة الطازجة. لحساب الخلايا، دوامة بلطف تعليق الخلية.
ثم باستخدام ماصة 10 ميكرولتر، مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من تريبان الأزرق وماصة بلطف الخليط صعودا وهبوطا أربع مرات لضمان تلطيخ كامل لسطح الخلية الخارجية مع الصبغة. بعد ذلك ، ضع غطاء فوق منطقة عد مقياس الدم. ثم ضع طرف ماصة تحتوي على خليط الخلية بجوار حافة coverslip وطرد بلطف محتوى تلميح في الشريحة العد.
بعد الانتظار لبضع دقائق لتسوية الطين، إصلاح مقياس الدم على مرحلة المجهر وعد الخلايا المتداخلة في أعلى أو الحكم الصحيح مع تجنب تلك المتداخلة أسفل أو اليسار الحاكم. وأخيرا، حساب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام هذه الصيغة. بعد أسبيراتينغ الوسط الثقافي، اغسل خلايا LX2 ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
فصل الخلايا باستخدام التريبسين كما هو موضح سابقا والطرد المركزي لهم. بعد عد الخلايا كما هو موضح سابقا، البذور مرة واحدة 10 إلى خلايا LX2 السادسة في أطباق 10 سنتيمتر مكعب واحتضان في 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة، جمع المتوسطة مكيفة الخلايا الليفية والطرد المركزي بيليه أي الخلايا العائمة.
تصفية تعقيم المتوسطة مشروطة باستخدام مرشح 0.22 ميكرون تعلق على حقنة 20 ملليلتر. ثم aliquot وسائل الإعلام في اثنين من أنابيب ملليلتر للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقمة إلى الجزء السفلي من طبق 10 سم مكعب لتوفير ظروف رطبة للشفرات.
ثم تعليق 1, 500 خلايا HCC HuH7 مع 1, 500 COS-7 خلايا الثدييات الليفية في قطرات معلقة لتشكيل المجالات. عكس غطاء الطبق للسماح للوسائط، بما في ذلك تعليق الخلية، لشنق على بيئة رطبة. بعد ثلاثة أيام ، لالتقاط صور للشفرات ، ضع الطبق على خشبة مسرح المجهر المقلوب وضبط التكبير إلى خمس مرات.
بعد ذلك ، افتح برنامج المجهر على الكمبيوتر المرفق وضبط تركيزه للحصول على صورة واضحة لكل كروية. ثم استخدم أداة المفاجئة على برنامج المجهر للحصول على الصور وحفظ الصور المكتسبة. أضف 10 ملليلترات من برنامج تلفزيوني معقم إلى الجزء السفلي من طبق 10 سنتيمتر مكعب.
ثم تعليق 3,000 خلايا HCC Hep3B في قطرات معلقة لتشكيل المجالات وعكس غطاء الطبق مما يسمح للقطرات لشنق فوق بيئة رطبة لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك ، قم بنقل كرويدات Hep3B إلى 20 ميكرولتر من وسائط الحالة الطازجة من خلايا LX2 في قطرات معلقة. ثم عكس غطاء الطبق الذي تتشكل عليه كرويدات وإصلاح الغطاء على خشبة المسرح من المجهر الخفيف.
ضبط التركيز الدقيق للمجهر لجعل كل كروية مرئية كما هو موضح سابقا. بعد الضغط على زر المكبس لتفريغ الهواء بعناية من micropipette ، أدخل طرف ماصة في القطيرات التي تحتوي على كروية ليتم نقلها. الحصول على مقربة جدا من كروية دون لمسها مع طرف.
بعد ذلك ، حرر بلطف الضغط على زر المكبس للسماح لشفط الكروي في طرف micropipette في اثنين من microliters من وسائل الإعلام. ثم نقل كروية إلى قطرة جديدة معلقة على طبق جديد 10 سنتيمتر مكعب. التقاط صور للشفرات في خمس مرات التكبير باستخدام المجهر مقلوب من يوم النقل حتى اليوم السابع من الثقافة في وسائل الإعلام LX2 مشروطة.
لتحليل صور كرويات متزايدة، افتح كل صورة كروية في برنامج تحليل الصور واستخدم أداة التحديد الحر لتحديد كل كروي. ثم من زر التحليل المنسدل، حدد قياس المجموعة، متبوعا بالمنطقة واضغط على موافق. بعد ذلك، رسم دائرة يدويا حول كل كروية وبمجرد أن تدور الدائرة، اضغط على Control M للسماح للبرنامج بحساب منطقة كروية بالبكسل. ثم قم بتحويل مساحة كروية إلى وحدة تخزين باستخدام هذه الصيغة.
وأخيرا، حساب التغيير في حجم كروية نسبة إلى حجمها في اليوم الأول من التقاط الصورة. خلال التحسين من كثافة الخلية لتشكيل كروية، وكثافات البذر أعلى من 12، 000 و 6، 000 الخلايا أسفرت كرويات مع شكل غير متماثل، في حين أن كثافة البذر من 3000 الخلايا أعطى الكمال تقريب كروية 3D. وهكذا، تم تكييف 3000 كروية كثافة الخلايا لمزيد من التجارب.
أظهر التقييم الطولي للتأثير التكاثري الناجم عن الورم المشارك وخطوط الخلايا الليفية أنه منذ اليوم الرابع فصاعدا ، نمت كرويات غير متغايرة في شكل مثالي يشبه الجولة مقارنة بشفرات التماثل. أظهرت كرويات الهتيروتبيك في البداية مرحلة نمو سريعة تبدأ من اليوم الرابع إلى اليوم السابع، تليها مرحلة أبطأ في اليوم الثامن. ثم انخفض حجم كروية في اليومين التاسع وال 10، مما يعكس ربما استنفاد المواد الغذائية أو نواة نقص الأكز وموت الخلايا.
وعلى النقيض من ذلك، أظهرت كرويات المثلية منحنى نمو ثابت نسبيا حتى اليوم الخامس، تليها زيادة تدريجية في منحنيات نموها من اليوم السادس فصاعدا. ارتفاع معدل نمو كرويات الخلايا الغيرية يشير إلى أن الاتصال المباشر بين الورم والخلايا الليفية يزيد من حجم كرويدات الورم. عندما نمت كرويات Hep3B المثلية التي يبلغ عمرها ثلاثة أيام في وسائل الإعلام الجديدة ، شكلت الخلايا كرويات مستديرة تماما بعد ثلاثة أيام وأظهرت انتشارا مستمرا حتى اليوم السابع.
تم تعزيز معدل النمو عندما تم الحفاظ على كرويدات في وسائل الإعلام LX2 مشروطة، مما يشير إلى انتشار الخلايا الليفية يحركها كرويدات الورم. من المهم التأكد من إضافة BBS العقيم إلى الجزء السفلي من الأطباق للحفاظ على حالة رطبة مناسبة لتشكيل كروية. أيضا، كن حذرا أثناء عكس الغطاء بحيث لا تتعطل كرويدات وقطرات.
يمكن إصلاح أو تجميد كرويات الورم ثلاثية الأبعاد وتخزينها للتطبيقات المستقبلية مثل الكيمياء المناعية أو الفلورة المناعية ، وكذلك استخراج الحمض النووي الريبي للتحليل النسخي. يمكن تصوير كرويات الخلايا غير المدارية ذات الخلايا المسماة مسبقا وتتبعها لتوفير رؤى حول تفاعلات الخلايا داخل البيئة الدقيقة للورم.
