Синтез белка без клеток является новой технологией в системах и синтетической биологии для производства белков в пробирке. Системы синтеза белка без клеток не имеют клеточной стенки, поэтому у нас есть прямой доступ к метаболитам. В этом протоколе мы количественно абсолютные измерения 40 метаболитов, участвующих в центральном метаболизме углерода и энергии, что позволяет нам охарактеризовать метаболизм без клеток.
Протокол опирается на метастазирование соединений с анилином, что позволяет лучшее разделение и более высокое разрешение масс-спектрометрии. Кроме того, мы используем внутренние стандарты с изотопным мы маркировать анилин, для абсолютной количественной оценки метаболитов. Помеченные метаболиты coelute, который устраняет последствия подавления железа.
Позволяет точной количественной оценки соединений. Работая в капоте, объедините 550 микролитров анилина с 337,5 микролитров воды класса LC-MS. И 112,5 микролитров 12 молярной соляной кислоты в центрифуге трубки.
Vortex хорошо, и хранить шесть молярных анилинового раствора при рН 4,5 и 4 градуса по Цельсию. Для приготовления шестимоляного углерод-13 анилинового раствора при рН 4.5 объединить 250 миллиграммов анилина углерода-13 со 132 микролитров воды и 44 микролитера 12 молирной соляной кислоты. Vortex хорошо, и хранить при четырех градусах по Цельсию.
Чтобы подготовить 200 миллиграммов на миллилитровый раствор EDC, растворите два миллиграмма EDC в 10 микролитров воды для каждого образца, который будет помечен. И вихрь хорошо. Для подготовки образцов, утолить и осадок белков в клеточной реакции синтеза белка, добавив равный объем ледяного 100% этанола к клеточной реакции синтеза.
Центрифуга образца на 12000 раз г, в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите супернатант образца в новую центрифугу. Чтобы обозначить образец раствором анилина углерод-12, перенесите шесть микролитров образца в новую центрифугную трубку и доввелите объем до 50 микролитров с водой.
Добавьте 5 микролитров по 200 миллиграммов на миллилитр раствора EDC, хорошо смешайте раствор анилина углерода-12 и перенесите в трубку 5 микролитров. Вихрь реакции с нежной тряски в течение двух часов при комнатной температуре. Через два часа снимите трубки со шейкера и перенесите их в дымовой капот.
Добавьте 1,5 микролитера триэтиламина к каждой реакции, чтобы остановить реакцию анилина пометки и стабилизировать соединения. Центрифуга при 13 500 раз г в течение трех минут. И спасти супернатанта.
Для маркировки внутренних стандартов раствором анилина углерод-13 разбавляют внутренний раствор бульона до 80 микромолеров с окончательным объемом 50 микролитров. Добавьте пять микролитров раствора EDC на миллилитр 200 миллилитров и пять микролитров хорошо смешанного раствора анилина углерод-13. Вихрь реакции с нежной тряски в течение двух часов при комнатной температуре.
Через два часа снимите трубки со шейкера и добавьте 1,5 микролитров триэтиламина в реакцию в дымовом капюшоне. Центрифуга при 13 500 раз г в течение трех минут и сохранить супернатант. Чтобы угадать помеченный внутренний стандарт и помеченный образец, смешайте 25 микролитров каждого в флаконе автозамперов.
И проанализируйте по процедуре LC-MS. Затем, чтобы создать стандартную кривую для негермета метаболитов, во-первых, разбавить фондовый раствор нетегами метаболитов в различных концентрациях, с объемом 50 микролитров. Добавьте пять микролитров раствора 200 миллиграммов на миллилитр EDC и пять микролитров анилинового раствора углерода-12 в каждую концентрацию.
Вихрь реакции с нежной тряски в течение двух часов при комнатной температуре. И приступить к лечению триэтиламином. И центробежка перед анализом LC-MS, как раньше.
После инициализации LC-MS, в соответствии с инструкциями производителя, введать пять микролитров образца в колонку. И приобрести соответствующие м над z ионных интенсивностей для углерода-12 анилин помечены образца. Затем снова ввилите пять микролитров одного и того же образца.
И приобрести м над z ионных интенсивностей для углерода-13 анилин помечены стандартами. В этом протоколе были количественно определены метаболиты, выражаюющие зеленый флуоресцентный белок в синтезе белка на основе E.coli. 40 метаболитов, участвующих в центральном метаболизме углерода и энергии, были обнаружены и количественно с использованием внутренних стандартов.
В то время как стандартная кривая для пяти метаболитов, которые не были помечены анилином, также была разработана. Разнообразные метаболиты, участвующие в этих путях, были классом фосфорилированных сахаров, фосфорно-карбоксиловых кислот, карбоксиловых кислот, нуклеотидов и софадов. Кроме того, метод позволил разделение структурных пар изомеров, таких как глюкоза-шесть фосфатов, и фруктоза-шесть фосфатов в одном LC-MS перспективе.
Наиболее важным шагом является маркировка де-белкового образца анилином. Поскольку анилиновое решение отделяется, важно работать быстро и эффективно, сохраняя при этом хорошие методы безопасности. Этот метод помогает охарактеризовать метаболизм без клеток с количественной оценкой 40 метаболитов.
Но, дополнительные соединения находятся в клеточной смеси, такие как аминокислоты, которые могут быть количественно. Это помогло бы в обеспечении более всестороннего взгляда на метаболизм без клеток. Этот метод показал, что безклеточные системы имеют сложные метаболизмы, все еще работающие, которые потенциально могут быть использованы для повышения энергоэффективности и урожайности углерода.
Протокол опирается на пометку соединений анилином с использованием EDC в качестве катализатора. Оба этих реагента опасны и должны использоваться с осторожностью.
