このプロトコルは、屈折率検出を使用して、一般的にライセートベースの無細胞系に蓄積される炭素代謝の副産物を測定します。また、質量分析を利用して、代謝的に活性なライセートで生成される中央代謝産物のより広範なパネルを検出します。このプロトコルで使用される2つの技術は、リセートベースの無細胞系で起こる化学反応を定量的に記述する能力を提供し、複雑なライセートバックグラウンドで低濃度に存在するものを含む、より広い範囲の代謝産物を検出することを可能にする。
この手順のデモンストレーションは、ハイメ・ロレンツォ・ディングラサンとデビッド・リーブス(バイオサイエンス部門の大学院研究員)です。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで異なる成分を組み合わせて、全糖タンパク質のミリリットル当たり4.5ミリグラムで最終的な反応を調製し始めます。無細胞代謝工学、またはCFME、時間のポイントあたりの三重で50マイクロリットルの最終量との反応を準備します。
各サンプルの最終反応量に5%トリクロロ酢酸等量を加えて、適切な時点で三重反応を直ちに終了します。次に、各反応混合物に滅菌水の2倍の体積を加えて各サンプルを希釈する。時間ゼロを再現するには、反応成分の残りを添加する前に、リセートとの総最終反応量と同じ5%トリクロロ酢酸の体積を混合します。
この酸性化工程は、糖を著しく代謝する前に、ライセート酵素を沈殿させる。ベンチトップのマイクロ遠心分離機上のサンプルと遠心分離機を11、600回gで5分間ボルテックスし、有機検体を含む上清を清浄なチューブに移した。HPLC分析を後で行う場合は、サンプルをマイナス20°Cで保存します。
次のステップに進む前に、氷の上に保存されたサンプルを解凍することを確認してください。0.22マイクロメートルの細孔フィルターで各上清をフィルター処理します。遠心分離機の後、各濾液をきれいなHPLCガラスバイアルに移します。
すでに分析用に設定されているHPLCシステムのオートサンプラートレイにバイアルをロードします。メニューバーから、シーケンス、新規シーケンステンプレートを選択します。[シーケンス] を選択します。
シーケンステンプレートをシーケンステンプレート名 S.Select シーケンス、シーケンステーブルとして保存します。N バイラルに対応する N 行を追加します。次に、オートサンプラートレイ上の配置に従って、バイアルとサンプル名の下にバイアルの位置とサンプル名を入力します。
[メソッド名]ドロップダウンメニューから原稿に記載されている方法を選択し、各行にバイアル当たり注入として50マイクロリットルを入力します。[適用]をクリックし、[シーケンス]、[シーケンステンプレートの保存]の順に選択して、シーケンステンプレートを保存します。シーケンス、ロードシーケンステンプレート、シーケンステンプレート名S.オンラインプロットで安定したベースラインを達成した後、パネルのRIDモジュール、制御、オフリサイクルバルブを右クリックして、RID検出器を通して溶媒の流れを廃棄物に導くことによって、シーケンステンプレートがロードされていることを確認してください。
データ取得を開始するには、メニュー バーから [シーケンス] を選択し、[シーケンス テーブル、実行] を選択します。[表示] メニューから [データ分析ビュー] を選択します。画面左側のファイルリストからシーケンスファイル名を見つけます。
画面の中央パネルで、信号ビュー選択、RID信号に移動してサンプルクロマトグラムを表示します。画面上の上部パネルから、サンプルのいずれかに対応する行を選択します。標的検体に対応するピークは、これらの代謝産物がすべて存在するサンプルにおいて、グルコース、コハク酸、乳酸塩、定酸、酢酸塩、およびエタノールとして保持時間軸に沿って配置される。
対象となるピークがソフトウェアによって十分に統合されているかどうかを確認します。赤い線は、各ピークのベースとして自動的に描画されます。赤い線が斜めの場合、自動統合は失敗しました。
次に、統合ツールセットから手動統合ボタンを選択し、ピークベースを手動で描画してピーク領域を統合します。共通ツールセットからカーソルツールを選択して、適切に統合されたピークをクリックします。選択したピークのピーク領域と対応する反応時間は、画面の下パネルに表の行として強調表示されます。
ピークエリアをエクスポートするには、[ファイル]、[エクスポート]、[統合結果]の順に選択します。スプレッドシート内のサンプルの既知の濃度に対して、ピークエリア値をプロットします。プロットされたデータを右クリックし、[近似曲線の追加]、[近似曲線の書式設定]、[グラフに数式を表示] を選択します。
別のスプレッドシートで、標準曲線トレンドラインの方程式を使用して、各サンプルから各分析対象のピーク領域値を濃度に変換します。データビジュアライゼーションの三数にまたがる平均ピークエリアと標準誤差値を計算します。原稿に記載されているように氷の上に、タイムゼロを除く、時間ポイントごとに三重反応を設定します。
グルコースの代わりに、反応に100ミリモルグルコース-13C6の最終濃度を使用する。1時間、2度、3時間、摂氏37度で反応をインキュベートします。分析を開始するために、各サンプルに抽出溶媒の同等の体積をピペットする。
サンプルを凍結した場合は、サンプルが完全に解凍する前に抽出溶媒を添加して、グルコース代謝の再活性化を防ぎます。氷上ですべてのサンプル処理手順を実行します。時間ゼロを再現するには、抽出溶媒の最終体積を適切な量の溶解物にピペットし、50マイクロリットルの反応体積で1ミリリットル当たり4.5ミリグラムの所望の最終濃度を得る。
前述のように残りの反応成分を加えます。この酸性化工程は、糖を著しく代謝する前に、ライセート酵素を沈殿させる。氷上の抽出溶媒にサンプルを穏やかな揺れで30分間インキュベートします。
次いで、サンプルを摂氏4度で15分間21,000倍のgで遠心分離し、沈殿したタンパク質から上清を分離する。50マイクロリットルの上清をオートサンプラーバイアルに移し、バイアルを4°Cオートサンプラー内のトレイに積み込みます。計測器の分析準備を終えたら、LC-MS/MSシステムのデータ取得および解釈ソフトウェアを使用して、実行シーケンスを設定します。
ロードマップの[シーケンス設定]で、テーブルを右クリックしてサンプルと同じ数の行を挿入します。各行に対して、射出量を5マイクロリットルに、位置をオートサンプラートレイ上のバイアルのそれぞれの位置に設定します。サンプル名としてファイル名を入力し、実行結果に必要なファイル パスを設定します。
実行を開始するには、シーケンス内のすべてのファイル名を強調表示します。メニュー バーから、[アクション]、[シーケンスの実行] の順に選択します。MZmine を開き、前に取得した生の出力ファイルをインポートします。
メニューバーから「生データ方式」「生データの読み込み」を選択し、サンプルに対応するファイルを選択します。原稿に記載されている手順に従って、MZmine 分析を完了します。MZmine 分析の最後に生のピーク領域を CSV ファイルとしてエクスポートします。
スプレッドシートを開いて、対象検索のグルコース代謝から 13C 標識代謝物の質量を計算します。MZmine 結果から質量電荷フィーチャーを検索してアサインするには、計算された 13C ラベルの代謝物の質量を使用します。品質ブラウザで、注釈のスペクトルを手動で確認し、注釈を確認します。
ロードマップ、クアルブラウザを開きます。ツールバーから、生のファイルを開いて、各サンプルの生の MS データをインポートします。質量スペクトルを表示するには、合計イオンクロマトグラムの推定注釈に対応する保持時間の所望の範囲の下に線を引きます。
HPLC-RID実験では、グルコースを反応の最初の3時間以内に消費し、主に乳酸に発酵させた。エタノールの蓄積も、反応の最初の3時間以内に顕著に発生し、その後停止した。酢酸塩は、最初はS30バッファーの成分として反応中に存在し、グルコース消費量が減速した6時間後に代謝のために蓄積された。
乳酸およびエタノールは、このように、ライセートベースの細胞を含まないグルコース代謝における主要な発酵の終末生成物と考えることができる。また、コハク酸との両方をマイナー発酵生成物として合成することが観察された。グルコース-13C6は、解糖性中間体の変動によって明らかなように、解糖分解を通じて観察的に消費された。
HPLC屈折率検出データと一致して、グルコースは乳酸-13C3に蓄積し、また、反応の最初の3時間以内にコハク酸-13C3に発酵させた。グルコース-13C6由来炭素を6-ホスホグルコノラクトン、6-ホスホグルコノラクトン、6-ホスホグルコナート、リブロース-5-リン酸、セドオエプツロース-7-リン酸に組み込むことも観察され、リセートグルコース代謝におけるペントースリン酸経路の関与を確認した。ライセートグルコース代謝はチロシン-13C9合成を供給し、ヒスチジン-13C5産生の前駆体も提供することが判明した。
コントロール サンプルがタイム ゼロを正確に表していることは重要です。したがって、溶解物中のタンパク質がエネルギー源を含む溶液中で混合する前に不活性化されることを確認してください。また、試験サンプル、制御サンプル、標準からのピークの自動統合も一貫しており、抽出されたピーク領域が同等になるようにします。
