Высокое давление — это метод выбора для изменения относительной популяции белкового конформационного образца. Он чрезвычайно полезен для выделения и характеристики высокоэнергетических конформационных состояний. По сравнению со всеми методами возмущения, такими как pH или температура, возмущение давления легко применяется и полностью обратимо.
Это также локальное возмущение, в первую очередь поражающее области со стеклянными полостями или объемами пустоты. Для начала введите образец с маркировкой азота-15 в циркониевую трубку с помощью стеклянной пипетки и убедитесь, что образцы сидят в нижней части трубки. Чтобы предотвратить смешивание образца с трансмиссионной жидкостью, наложите на образец 200 микролитров минерального масла, а затем заполните остальную часть трубки трансмиссионной жидкостью.
Положите одноразовое уплотнительное кольцо поверх циркониевой трубки и сдвиньте трубку в основание. Затем подключите трубку к линии троса высокого давления и вручную затяните основание к ячейке. Затем примените крутящий момент 14,7 ньютон-метров для предотвращения утечек при более низком давлении.
Чтобы проверить целостность ячейки давления в сборе, нажмите трубку до 300 бар вне спектрометра с помощью ячейки поддержки и защитного сосуда. Через 15 минут сбросьте давление до одного бара и проверьте наличие утечек с помощью чистой безворсовой салфетки. Вставьте трубку без давления в спектрометр, осторожно направляя линию троса.
Вставьте трубку в спектрометр до тех пор, пока трубка не достигнет положения образца сидя. Запирайте, прокладывайте, сопоставляйте и настраивайте протоевые и азотные каналы и сохраняйте оптимизированные прокладки для будущего. Настройте поперечную релаксационную оптимизированную спектроскопию с гетеро-одноквантовой когерентной спектроскопией и приступайте к записи эталонного эксперимента в атмосферных условиях.
Запишите серию 2D-экспериментов от одного бара до 2,5 килобар на каждые 500 баров. Если известны точные скорости складывания или разворачивания, после каждого 500-барного приращения пусть образец уравновешивается в течение 15-20 минут. Когда точка перегиба складного или разворачивающегося перехода достигает, запишите дополнительные эксперименты, чтобы повысить точность подгонки.
Этот протокол был использован для исследования зависимости давления RRM2, второго мотива распознавания РНК гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина A1. Поперечная релаксационная оптимизированная спектроскопия с гетеро-одноквантовой когерентной спектроскопией была собрана при одном баре, 1,5 килобарах, двух килобарах и 2,5 килобарах. RRM2 почти полностью развернут в диапазоне 2,5 килобар. Отдельные профили интенсивности давления были установлены в соответствии с уравнением, показанным здесь, для получения соответствующих изменений в стандартной свободной энергии и объеме Гиббса, связанных с разворачивающейся реакцией.
При нанесении на карту доменной структуры остатки с наибольшей величиной изменения объема были обнаружены в структурном ядре домена, в то время как остатки с наименьшей величиной изменения объема были в основном расположены в соединительных петлях между бета-нитями и бета-нитями к концевой спирали C. Для исследования степени сжимаемости и конформационной неоднородности ансамбля складчатого состояния были проанализированы химические сдвиги протия. Отдельные профили химических сдвигов протия в зависимости от давления были установлены с использованием показанного уравнения для извлечения линейных и нелинейных коэффициентов для конкретного участка.
Остатки с наибольшими нелинейными коэффициентами были в основном обнаружены в структурном ядре домена, в то время как остатки с наименьшими нелинейными коэффициентами были в основном расположены внутри петель, соединяющих различные структурные мотивы. Важно правильно настроить трубку как напорную установку, чтобы предотвратить утечки. Если произойдет утечка, зонд, вероятно, придется удалить, чтобы очистить любые следы минерального масла.
