Этот протокол может быть использован для обнаружения и характеристики конформационной динамики белка, которые необходимы для понимания большого разнообразия клеточных процессов. По сравнению с другими методами, этот метод не требует специализированных этапов подготовки образцов и обеспечивает всестороннюю характеристику кинетики, термодинамики и структурных аспектов подтверждающего равновесия. Релаксационная дисперсия CPMG может применяться более широко для характеристики конфирмационной динамики в нуклеиновых кислотах и других биомолекулах, а также для характеристики взаимодействий лигандных наночастиц.
Наш протокол предназначен для начинающих пользователей CPMG. Так что это хорошая отправная точка. Тем не менее, мы ожидаем, что пользователи будут знать основные шаги для запуска обычных экспериментов ЯМР.
Чтобы настроить эксперимент ЯМР в первый раз, сначала загрузите и распакуйте эти дополнительные файлы. Скопируйте биты. vv и trosy_15N_CPMG.
vv файлы в папке программы pulse в каталог программы pulse. Откройте программное обеспечение для сбора и используйте команду EDC, чтобы скопировать ранее запущенный эксперимент с водородным азотом 15 HSQC в новый эксперимент. Используйте команду pulse program для загрузки trosy_15N_CPMG.
vv импульсный программный файл во вновь созданный эксперимент. Затем используйте инструкции из конца файла импульсной программы для настройки эксперимента CPMG. Чтобы создать рутинный эксперимент ямР, введите образец в магнит и выполните все основные этапы сбора ЯМР.
Установите P1 на длительность водородных жестких 90 градусов импульсов, а P7 на длительность азотных 15 жестких 90 градусов импульсов. В окне сбора установите центр и спектральную ширину для водорода и азота 15 измерений. Установите задержку релаксации на 0,7 T2 и используйте команду VC list для создания списка целых чисел, соответствующих N.После подтверждения того, что каждая запись в списке соответствует другому полю CPMG в соответствии с поданным CPMG равным 4N, деленному на D30, убедитесь, что первое число в списке равно нулю.
Установите L8 на число записей в списке VC, L3 на число реальных точек для косвенного измерения и 1TD на L8 умножь L3 на два. Чтобы оптимизировать подавление воды, установите коэффициент усиления приемника на один и введите EDC pull, чтобы открыть файл импульсной программы. В строке 91 удалите точку с запятой, предшествующую goto 999, и сохраните файл.
С помощью команды GS настройте параметры SPDB0, чтобы свести к минимуму интенсивность сигнала FID. Когда интенсивность сигнала будет изменена, снова ввести точку с запятой в строке 91 файла импульсной программы и сохраните файл. Чтобы оптимизировать SPDB11, установите коэффициент усиления приемника в один раз, а тип EDC pull для открытия файла импульсной программы.
В строке 168 удалите точку с запятой, предшествующую goto 999, и сохраните файл. С помощью команды GS настройте параметры SPDB11, чтобы свести к минимуму интенсивность сигнала FID. После изменения интенсивности сигнала снова вставляйте точку с запятой в строке 168 и сохраните файл.
Чтобы оптимизировать SPDB2, установите коэффициент усиления приемника на один и введите EDC pull, чтобы открыть файл импульсной программы. В строке 179 удалите точку с запятой, предшествующую goto 999, и сохраните файл. С помощью команды GS настройте параметры SPDB2, чтобы свести к минимуму интенсивность сигнала FID.
После изменения интенсивности сигнала повторно введите точку с запятой в строке 179 файла импульсной программы и сохраните файл. Чтобы оптимизировать PLDB2, установите коэффициент усиления приемника на один и введите EDC pull, чтобы открыть файл импульсной программы. В строке 184 удалите точку с запятой, предшествующую goto 999, и сохраните файл.
С помощью команды GS отрегулируйте параметры PLDB2, чтобы свести к минимуму интенсивность сигнала FID. После изменения интенсивности сигнала снова ввести точку с запятой в строке 184 файла импульсной программы и сохранить файл. Выполните команду RGA, чтобы оптимизировать коэффициент усиления приемника.
Затем выполните команду ZG, чтобы начать эксперимент. На этом рисунке можно наблюдать результаты профилей дисперсии релаксации, полученных для каждого пика в спектре водородного азота 15 Троси. По полученным профилям дисперсии релаксации можно оценить обменный вклад в поперечную релаксацию азота 15 каждой основной группы AMI.
Построив поперечную релаксацию на 3D-структуре исследуемого белка, можно идентифицировать структурные области, подвергающиеся подтверждающего обмену на микросекундной миллисекундной шкале времени. Моделирование кривых дисперсии релаксации с использованием уравнений Карвера-Ричардса возвращает термодинамические и кинетические параметры обменного процесса, такие как дробные популяции состояний в равновесии и обменный курс между этими состояниями. Температурная зависимость этих термодинамических и кинетических параметров затем может быть смоделирована с использованием уравнений Ван'т Гоффа и I-кольца соответственно для получения подробной информации об энергетике подтверждающего обмена.
Крайне важно тщательно оптимизировать все параметры сбора, в частности P7. Также важно производить высокочистые и однородные образцы, чтобы избежать ложных дисперсий. Кинетические, термодинамические и химические параметры чипа, полученные с помощью этого протокола, могут быть использованы для получения энергетической и структурной информации о видах, подвергающихся подтверждающего обмену. Характеристика подтверждающей динамики белка, полученная методами CPMG, дает важную информацию для понимания сигнальной и ферментативной активности, а также новые перспективы для разработки лекарств.
