Удлиненный и поляризованный амелогенинсекретирующий амелобласт в культуре. Это также первый протокол для выращивания клеток амелобласта в условиях микрогравитации. Рост амелобластов в культуре был одной из основных проблем в области эмали.
И для нас это использование этой модели биореактора, это первый раз, когда мы достигли этой отличительной черты в исследованиях эмали. Эта модель может быть использована для понимания биологии клеток амелобласта. Эту модель продемонстрирует доктор Мирали Пандья.
Начните с помещения собранной ткани шестидневных послеродовых мышей под рассеченный микроскоп и рассеченные шейные петли. Установите биореактор, прикрепив стерильные клапаны к отверстиям шприца. Добавьте обе клетки, шейную петлю и пульпу зуба, вместе с покрытым каркасом в биореактор и заполните сосуд биореактора 10 миллилитрами кератиноцитарной среды SFM, дополненной факторами роста и белками внеклеточного матрикса.
Закройте и затяните крышку заправочного отверстия сосуда биореактора, затем откройте стерильные клапаны. Используйте два стерильных трехмиллилитрового шприца для смены среды. Для этого наполните один шприц свежей средой и оставьте другой шприц пустым.
Откройте оба шприцевых клапана и осторожно наведите пузырьки на пустой шприц-порт. После того, как свежая среда из полного шприца будет тщательно введена в сосуд, удалите все пузырьки через пустой шприц-порт. Закройте порты шприца колпачками.
Прикрепите каждый сосуд к основанию ротатора. Включите питание и установите скорость 10,1 оборотов в минуту. Отрегулируйте скорость, чтобы строительные леса находились в подвешенном состоянии и не касались стенки сосуда.
Для смены среды каждые 24 часа поместите сосуды вертикально, чтобы клетки осели на дне. Откройте порты шприца, чтобы подключить стерильные шприцы к портам. Аспирировать 75% истощенной питательными веществами среды и вводить свежую среду через другой порт, как было продемонстрировано ранее.
Здесь показаны макрографы графенового каркаса и коллагенового каркаса. Графеновый каркас имел параллельный массив поверхностных рельефов, в то время как коллагеновый каркас демонстрировал пористую структуру. Скелетонизированная нижняя челюсть мыши была рассечена, и дистальная большая часть нижнего резца мыши была обнажена.
Точное положение резецированной шейной петли разграничено в шестидневном послеродовом резце мышиного резца, в то время как аналогичная область во взрослой скелетонизированной нижней челюсти мыши предоставляется в качестве эталона. Гемимандиблы состояли из трех нижнечелюстных моляров и постоянно растущего резца, в то время как ниша клеток шейной петли содержала разнообразную клеточную популяцию, необходимую для формирования эмали. Успешная дифференцировка клеток цервикальной петли в адаптированной микросреде привела к образованию амелобластов с типичной характеристикой поляризованных клеток с ядром на одном конце и длительными клеточными процессами на другом.
Культура клеток в одних только средах без факторов роста и каркасного покрытия привела к образованию клеток цервикальной петли, которые секретировали ключевые белки эмали, но не удлинялись и не поляризовались. Группа каркасов, покрытая галанином, продемонстрировала значительно более высокую скорость пролиферации по сравнению с контрольной группой, содержащей каркасы без покрытия. Сегменты легочной ткани, собранные у мышей E15, успешно культивировались в течение 10 дней в среде 3D-микрогравитации в биореакторе.
Добавление интерлейкина-6 в культуральную среду привело к воспалению связанных с воспалением изменений альвеолярной морфологии, аналогичных тем, которые наблюдаются in vivo. Во введении я рассказал вам, как трудно было команде эмалировать модель культуры клеток амелобласта. Теперь мы решили эту проблему, используя очень инновационную процедуру, которая фокусируется на двух аспектах: губчатый коллагеновый каркас, а также использование матрицы для дифференцировки клеток амелобласта.
Вместе эти две инновации привели к поляризации и росту амелобластоподобных клеток в 3D-культуре. Эти 3D-культивируемые клетки являются прекрасной моделью для понимания биологии амелобласта. И чтобы понять эту биологию, мы можем использовать различные методы, включая электронную микроскопию, протеомику и геномику.
Амелобласты — фантастические клетки. Да, они обладают способностью выделять призматическую зубную эмаль. Теперь эта модель биореактора дает нам возможность понять, как амелобласты секретируют матрицу и выделяют минералы апатита для выращивания призматической зубной эмали.
