Этот метод позволяет нам изучать влияние моделируемой микрогравитации на иммунные клетки, чтобы помочь нам лучше понять, как аспекты космической среды влияют на физиологию человека на молекулярном уровне. Этот метод экономически целесообразен и относительно прост в настройке и обслуживании по сравнению с отправкой клеточной культуры в космос или другими методами воздействия на клеточную культуру моделируемой микрогравитации на Земле. Рекомендуется медленно заполнять сосуды, чтобы избежать переполнения и разлива.
После первоначального удаления пузырьков убедитесь, что сосуды полностью заполнены с помощью шприцев. Это сведет к минимуму вероятность образования крупных пузырьков на протяжении всего лечения. Начните с того, что выньте сосуды для культивирования из пластиковой упаковки.
Пометьте каждый сосуд на ободе в соответствии с типом клетки или используемой линией, независимо от того, находится ли она в контроле или лечении, а также в любой другой соответствующей информации. Стабилизируйте сосуд и осторожно откройте заливное отверстие, не касаясь колышка крышки заливного порта или уплотнительного кольца. Поместите колпачок на прокладку для этанола колышком или уплотнительным кольцом вверх, пока сосуд заполнен.
Не снимайте колпачки с портов шприца. Загрузите в сосуд 10 мл соответствующей полной среды для клеточной культуры с помощью стерильной серологической пипетки и осторожно поместите крышку на заливное отверстие. Убедитесь, что крышки порта шприца и заливной порт надежно закрыты.
Затем поместите заполненные сосуды в инкубатор, выполняя последующие шаги, чтобы подготовить сосуды для культивирования клеток. Извлеките из инкубатора сосуды, заполненные средой. Для контроля колбы загрузите колбу для культуры суспензии T25 10 мл клеточной культуры из приготовленного выше сырья.
Добавьте 10 мл исходной клеточной культуры в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл, которая будет использоваться для загрузки шприцев. Отвинтите крышки портов шприца, чтобы извлечь их из сосуда, и убедитесь, что стандартные запорные краны находятся в открытом положении. Стабилизируйте сосуд и осторожно откройте заливное отверстие, не касаясь колышка крышки заливного порта или уплотнительного кольца.
Поместите колпачок на прокладку для этанола колышком или уплотнительным кольцом вверх, пока сосуд наполняется. Убедитесь, что запорные краны находятся в открытом положении. Сосуд можно опорожнить, вылив среду из сосуда в контейнер для отходов с помощью серологической пипетки.
В качестве альтернативы можно аспирировать носитель с помощью стерильного стекла мимо пипетки, прикрепленной к вакуумной системе. При использовании пипетки или вакуумной системы не прикасайтесь к оксигенационной мембране, так как это может повредить ее и сделать сосуд непригодным для использования. Плотно закройте коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую подготовленную исходную клеточную культуру, и осторожно переверните ее несколько раз, чтобы тщательно перемешать содержимое.
Извлеките 10 мл материала клеточной культуры из пробирки объемом 50 мл свежей стерильной серологической пипеткой. Поднимите сосуд и наклоните его так, чтобы заливное отверстие было направлено вверх. Затем осторожно распределите запас клеточной культуры в сосуд через заливное отверстие.
Наполните сосуд прямо до кончика заливного отверстия, наклоняя сосуд обратно вниз, чтобы избежать проливания. Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться пипеткой к мембране оксигенации, так как она очень хрупкая. После загрузки судна осторожно снова наденьте крышку заливного порта, не касаясь уплотнительного кольца.
Извлеките первый шприц объемом 3 мл из упаковки и прокачайте его несколько раз, чтобы ослабить его. Затем прикрепите шприц к одному из портов шприца, убедившись, что шприц полностью нажат. Плотно закройте коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл аликвотной клеточной культуры, и осторожно переверните ее несколько раз, чтобы тщательно перемешать содержимое.
Точно так же извлеките из упаковки второй шприц объемом 3 мл и прокачайте его несколько раз. Затем осторожно полупогружают этот шприц в клеточную культуру из конической пробирки объемом 15 мл и извлекают немного культуры. Сведите к минимуму пузырьки воздуха, полностью дозировав шприц обратно в пробирку и набрав 3 мл культуры.
Прикрепите наполненный шприц к оставшемуся порту шприца и тщательно продезинфицируйте шприцы и вокруг заливного отверстия прокладкой для этанола. Не допускайте попадания этанола на оксигенационную мембрану. Повторите процесс для остальных сосудов.
Если в конической пробирке объемом 50 мл для последнего сосуда осталось немного недостаточно клеточной культуры, извлеките оставшееся количество из конической трубки объемом 15 мл, используемой для загрузки шприцев. Убедитесь, что запорные краны порта шприца закрыты, чтобы ограничить миграцию клеток и пузырьков из шприцев в сосуды. Переверните сосуд вверх дном и несколько раз ударьте его по сторонам, чтобы собрать первоначальные пузырьки.
Быстро переверните сосуд спиной вверх, а затем под небольшим углом в сторону, чтобы все пузырьки всплыли на восходящую сторону сосуда. Маневрируйте пузырьками под портом с помощью пустого шприца и наблюдайте, как они начинают входить в порт. Откройте оба запорных крана порта шприца.
Осторожно ударьте по сосуду, чтобы пузырьки всплыли в пустой шприц. Медленно всасывайте большие пузырьки пустым шприцем, осторожно нажимая на полный шприц, чтобы поддерживать давление в сосуде, чтобы мембрана оксигенации не лопнула. Повторите этот процесс несколько раз, чтобы убедиться, что все пузырьки удалены.
Когда пузырьки будут эффективно удалены, закройте запорные краны порта шприца. Держите шприцы включенными во время лечения, чтобы обеспечить последующее удаление пузырьков, убедившись, что объем в обоих шприцах примерно одинаков. Тщательно протрите поверхность вращающегося основания и ленточного кабеля 70% этанолом.
Убедитесь, что ленточный кабель подключен к источнику питания. Поместите вращающееся основание в инкубатор и прикрепите ленточный кабель к основанию. Разместите блок питания рядом, но снаружи инкубатора.
Прикрепите сосуд для обработки SMG, выровняв резьбу сосуда с вращающимся штифтом и осторожно повернув вращающийся штифт на основании против часовой стрелки. Убедитесь, что сосуд надежно закреплен. Поддерживайте влажность инкубатора примерно на 100%, заполнив поддон для воды водой обратного осмоса в автоклаве.
Отрегулируйте скорость вращения инкубатора в соответствии со скоростью осаждения клеток, чтобы клетки не проваливались через среду. В первый день после начала лечения проверяйте наличие пузырьков каждые несколько часов, как описано в текстовой рукописи. Удаляйте пузырьки не реже одного раза в день до конца желаемой продолжительности лечения.
По истечении запланированной продолжительности лечения остановите вращение и разберите аппарат. Снимите лечебный сосуд, осторожно удерживая сосуд в неподвижном положении, поворачивая вращающийся штифт устройства по часовой стрелке. Перенесите контрольную колбу, контрольную и обработанную емкость в стерильный шкаф биологической безопасности.
Возьмите каждый сосуд, исключая контрольную колбу, и переверните его так, чтобы он был обращен вниз. Затем аккуратно ударьте по нему, чтобы привести все клетки во взвешенное состояние. Затем поверните сосуд на бок так, чтобы заливное отверстие было направлено ко дну, и ударьте по нему еще раз, чтобы направить ячейки к заливному отверстию для эффективной аспирации.
Обрабатывайте каждое судно индивидуально. Открутите шприцы из двух портов и распределите их в биологически опасные отходы. Откройте запорные краны на портах шприца.
Осторожно снимите крышку заливного порта и вытащите содержимое стерильной серологической пипеткой объемом 10 мл, наклоняя сосуд по мере его опорожнения. Распределите содержимое всех контрольных и лечебных групп в конические пробирки объемом 15 мл с индивидуальной маркировкой. Закройте каждую трубку и аккуратно переверните их несколько раз, чтобы убедиться, что они правильно перемешаны.
Используйте предпочтительный метод определения концентрации и жизнеспособности полученной клеточной культуры для подготовки к последующим экспериментальным анализам. Начальную жизнеспособность клеточной линии NK-92 и плотность посадки сравнивали с результирующей конечной жизнеспособностью и конечными концентрациями. После 72-часового лечения SMG сравнивали два случая отрицательных и положительных результатов.
Для сравнения, оптимальный диапазон концентрации используемой клеточной линии NK-92 составлял от 0,3 до 1,2 миллиона клеток на миллилитр со временем удвоения около двух-трех дней. Пролиферация в группе лечения SMG была примерно одинаковой в контрольной и лечебной группах. Эти параметры были необходимы для успеха последующих экспериментов, и полученные клетки из двух контрольных групп показали аналогичные результаты в последующих экспериментальных анализах.
Крайне важно контролировать и учитывать образование пузырьков на протяжении всего курса лечения, особенно в культуре клеток, подвергающейся имитации микрогравитации. Образование больших пузырьков может привести к нарушению динамики жидкости внутри сосуда, и это по существу сведет на нет моделируемое состояние микрогравитации.
