Этот протокол описывает метод, который позволяет идентифицировать специфичные для сайта окисленные цистиновые остатки белков. Метод позволяет получать количественные и специфические для участка данные об окисленных остатках цистина из различных типов образцов. Чтобы начать процедуру вспомогательного захвата, дважды промывайте осажденные белковые гранулы ацетоном путем центрифугирования при 20 500 г, в четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Затем декантируйте ацетон и удалите оставшийся ацетон микропипеткой. С помощью стеклянной серологической пипетки добавьте в трубку три миллилитра свежего ледяного ацетона и хорошо перемешайте, перевернув трубку несколько раз. После второй промывки дайте гранулам высохнуть на воздухе в течение одной-двух минут, не давая им высохнуть.
Добавьте один миллилитр буфера В к высушенной белковой грануле. Чтобы солюбилизировать белок, повторно обжажайте гранулу ультразвуком в анализаторе ванны с выходом 250 Вт в течение 15-30 секунд за раз, вместе с коротким вихрем. Выполните анализ бицинхониновой кислоты или BCA для измерения концентрации белка.
Чтобы стандартизировать концентрации белка, перенесите 500 микрограммов образца белка в центробежный фильтр 0,5 миллилитра, 10 килодалтонов и увеличьте объем образца до 500 микролитров с буфером повторного суспензии. Центрифугируют белковую буферную смесь при 14 000 г при комнатной температуре, пока объем в центробежном фильтре не составит менее 100 микролитров. Соберите образец, инвертировав фильтр в коллекторной трубке.
Центрифугируйте образец при 1000 G в течение двух минут и добавьте буфер C, чтобы получить конечный объем 500 микролитров. Чтобы уменьшить тиолы белка, добавьте 20 микролитров 500 миллимолярного дитиотрейтола или DTT к образцу, чтобы получить конечную концентрацию 20 миллимоляров, и инкубируйте образцы в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 850 об/мин. После восстановления центрифугируют образцы в центробежные фильтры объемом 0,5 миллилитра 10 килодалтон при 14 000 Г при комнатной температуре, пока объем в центробежном фильтре не составит менее 100 микролитров.
Добавьте буфер D, чтобы увеличить объем до 500 микролитров и повторите центрифугирование. После четвертой центрифугирования соберите образцы, инвертировав фильтр в коллекторной трубке для центрифуги при 1000 G в течение двух минут. Затем измерьте концентрацию белка с помощью анализа BCA.
Затем поместите спиновые колонны на вакуумный коллектор и с помощью микропипетки перенесите 500 микролитров свежеприготовленной тиол аффинной смолы в каждую колонку. Примените вакуум для удаления воды. Повторите процедуру один раз, чтобы получить 30 миллиграммов смолы на столбец.
Промыть смолу пять раз 500 микролитрами сверхчистой воды, применив вакуум для удаления воды, а затем пять раз с 500 микролитрами буферной E.In новой пробирке, добавить буфер С к 150 мкг восстановленного образца белка до тех пор, пока конечный объем не составит 120 микролитров. Перенесите белковый раствор в закупоренную спиновую колонку, содержащую смолу. Поместите колпачок на колонку и высиживайте в течение двух часов при комнатной температуре с встряхиванием при 850 об/мин.
Промыть смолу, как описано в рукописи. Замените вилку. Чтобы выполнить триптическое сбраживание на смоле, добавьте в образцы 120 микролитров свежеприготовленного раствора трипсина и высиживайте столб в течение ночи при 37 градусах Цельсия, с встряхиванием при 850 об/мин.
На следующий день промыть смолу несколько раз, как описано в рукописи, и заменить пробку. Используя микропипетку, добавьте 40 микролитров 100 миллимолярного бикарбонатного буфера триэтиламмония в промытую смолу. Затем добавляют 70 микролитров растворенной тандемной массы метки или реагента для маркировки ТМТ, и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре с встряхиванием при 850 об/мин.
Храните оставшийся реагент ТМТ при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Вымойте смолу и замените заглушку. Элюируют меченые ТМТ пептиды путем добавления 100 микролитров 100 миллимолярного бикарбонатного буфера аммония при рН 8,0, содержащего 20 миллимоляров DTT, в колонку и инкубации колонны на термомешалке при комнатной температуре в течение 30 минут при 850 об/мин.
После инкубации выполняют элюирование, помещая колонну на вакуумный коллектор, применяя вакуум и элюируя образцы в пятимиллилитровую микроцентрифужную трубку. Повторите этап один раз, затем добавьте в колонку 100 микролитров 80% ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой. После инкубации колонки в течение 10 минут при комнатной температуре элюируют образец в той же пятимиллилитровой центрифужной трубке.
Поместите элюированные образцы в вакуумный концентратор до высыхания. Затем храните сухие пептиды при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Качественный анализ пептидных образцов из raw 264.7 клеток проводили с помощью SDS-PAGE, где образцы сравнивали путем определения различных уровней окисления из-за обработки.
Разделенные белки были впоследствии исследованы западным блоттингом для дальнейшего изучения уровней окисления отдельных белков. Сообщаемые интенсивности ионов цистинсодержащих пептидов анализировали с помощью жидкостной хроматографической тандемной масс-спектрометрии. Была количественно определена стехиометрия окисления тиола iTRAQ, меченых обогащенными и окисленными пептидами на отдельных уровнях цистинового сайта.
Осторожно удалите ацетон, не нарушая белковую гранулу. Убедитесь, что белковая гранула полностью солюбилизирована и точно количественно оценена, а смола точно распределена по спиновым колонкам. Обязательно повторно суспендируйте смолу во время этапов стирки.
Дальнейшая оценка обогащенных белков и пептидов может быть выполнена с помощью SDS-PAGE и окрашивания, западного блоттинга и масс-спектрометрии.
