Бисерная загрузка – это недорогой анализ для загрузки мембранных, непроницаемых частиц в живые адгезивные ячейки. Этот протокол оказался чрезвычайно полезным для загрузки зондов для экспериментов с одноклеточной или одной молекулой или флуоресцентной микроскопии. Загрузка шариков позволяет исследователям быстро загружать всевозможные молекулы, включая белки, ДНК, РНК, синтетические частицы или их комбинацию одновременно в отдельные клетки.
При первом выполнении загрузки бусин важно проверить силу нарезания резьбы. Клеточные линии по-разному реагируют на загрузку бусин. Таким образом, количество и сила кранов могут быть изменены для оптимальной загрузки ячеек при минимизации раскатов ячеек.
Чтобы продемонстрировать процедуру Мэтью Сакстон и я, присоединимся к нашим коллегам, доктору Аманде Кук и Габриэлю Галиндо. Начните с измерения примерно пяти миллилитров стеклянных шариков в конической трубке размером 50 миллилитров. Добавьте в трубку 25 миллилитров двух молярных гидроксидов натрия и осторожно перемешайте в течение двух часов с помощью шейкерного аппарата или ротора.
Закрутите трубку бусин ненадолго в центрифуге, если шарики находятся в суспензии, затем декантировать гидроксид натрия, сохраняя при этом как можно больше бусин. Тщательно вымойте шарики водой для клеточных культур до тех пор, пока рН не станет нейтральным, и каждый раз декантирует воду. Используйте тест-полоску pH на сточных вод, чтобы подтвердить нейтральный рН, затем тщательно промыть шарики 100% этанолом, два-три раза.
Декантирование этанола каждый раз. Высушите бусины и посыпьте их, чтобы они образовали тонкий слой внутри стерильного контейнера. Затем оставьте контейнер открытым внутри шкафа для биобезопасности, чтобы высушить шарики на воздухе в течение ночи.
Осторожно постучите или встряхните контейнер и убедитесь, что бусины имеют песчаную текстуру без слипания или шелушечания, чтобы убедиться, что бусины полностью высохли. Добавьте бусины к аппарату и закройте все отверстие камеры для хранения шариков с помощью полипропиленовой сетки или эквивалентного материала с отверстиями 105 микрометров, чтобы шарики могли пройти. Зажмите сетку между мужским и женским концами металлической многоразовой камеры визуализации, затем плотно запечатайте ее восковой пленкой и УФ-стерилизуйте аппарат в течение 15 минут.
Аппарат погрузчика бусин теперь можно использовать для выполнения сотен нагрузочных анализов. Храните аппарат в сухом контейнере, высушиваемом силикагелем или другой адсорбцируем, и герметизируем его. Если бусины становятся самосвалом, тщательно высушите и стерилизуйте загрузчик бусин и замените его свежими бусинами, как было показано ранее.
Удалите среду из клеток и аккуратно аспирируйте всю среду по краям камеры. Затем наклоните камеру примерно под углом 45 градусов и удалите оставшуюся каплю среды в центральном микроямоните. Пипетка бусины осторожно загружается на стеклянную микроразмноженную хорошо присутствуют в центре камеры.
Используйте устройство для загрузки бусин, чтобы аккуратно диспергировать монослой стеклянных шариков поверх ячеек. Убедитесь, что бусины полностью покрывают ячейки. Зажмите камеру двумя пальцами, поднимите ее примерно на два дюйма и плотно опустите, используя силу, примерно эквивалентную падению тарелки с этой высоты, осторожно добавьте среду обратно в камеру, медленно пипеткой на пластиковую сторону камеры.
Аспирировать любые плавающие бусины, не нарушая клетки, вся процедура загрузки бусин должна выполняться относительно быстро. Таким образом, клетки не высыхают, когда они без среды. Затем инкубируют клетки от 4,5 до двух часов в инкубаторе.
Перед визуализацией промыть ячейки три раза средой для удаления шариков и избыточных нагрузочных компонентов в нагрузочном растворе. Визуацируйте ячейки сразу или по мере необходимости эксперимента, используя инструкции в текстовой рукописи. Клетки, которые были успешно загружены шариками, почти всегда имели Cy3-Pa57 и A488-H3K11ac, помеченные белками вместе.
Один микрограмм плазмидной ДНК и кодирующий GFP и 0,5 микрограмма меченого Cy3 белка также были введены в клетки посредством экспрессированной и визуализированной нагрузки на шарики. 40% клеток были загружены фаб-белком, а 21% клеток, загруженных шариками, экспрессировали плазмиду, нагруженную ядром. Бусинчатые нагруженные клетки экспрессировали различные уровни плазмиды.
Результат этого теста на соотношение Фишера показал, что, хотя белки один и два имели одинаковое распределение интенсивности, каждый белок имел значительно меньшее распределение, чем плазмида. Уровни белков, нагруженных бисером, имели небольшую дисперсию от клетки к клетке, а уровни двух одновременно загруженных белков были сильно коррелированы друг с другом. Правильная загрузка бусин почти не оказала заметного влияния на количество человеческих клеток U2OS или их морфологию при изображении непосредственно до, непосредственно после и через 24 часа после загрузки бусин.
Плохая загрузка бусин с чрезмерными бусинами и усилием постукивания вызывала потерю клеток, плохую морфологию клеток и скопления бусин, оставшихся на покровном стекле. несмотря на то, что считается, что клетки подвергаются механическому повреждению во время того, как шариковые загрузочные ячейки росли и размножались в камере, нагруженной бусинами. Также было отмечено, что шариковые нагруженные клетки, подвергаются делению клеток.
Линии RPE1 и HeLa были нагружены шариками, чтобы продемонстрировать универсальность техники загрузки бусин. Клетки U2OS также были загружены Cy5-РНК 9-мер и Cy3-ДНК 28-мер вместе. При попытке этого протокола убедитесь, что вы добавляете только монослой бусин к ячейкам, так как слишком много бусин приводит к отсоединению клеток.
Таким образом, после короткого 30-минутного восстановления после этого нагрузочные клетки готовы к визуализации либо немедленно, либо через несколько часов, если процедура требует дальнейших шагов, таких как окрашивание, которое может быть сделано и после периода восстановления.
