珠子将蛋白质和核酸加载到附体人类细胞中

珠子加载是一种廉价的检测，用于将膜、不透水的颗粒加载到活的粘附细胞中。该协议已被证明是非常有用的加载探头为单细胞或单个分子或荧光显微镜实验。珠子加载使研究人员能够快速将各种分子（包括蛋白质、DNA、RNA、合成粒子或这些粒子的组合）快速加载到单个细胞中。

当第一次执行珠子加载时，重要的是要测试出敲击力。细胞线对珠子加载的反应不同。因此，水龙头的数量和力可以修改为最佳的细胞加载，同时最大限度地减少细胞的窥视。

为了证明这个程序，马修·萨克斯顿和我的同事阿曼达·库克博士和加布里埃尔·加林多将加入这个程序。首先在50毫升圆锥管中测量大约5毫升的玻璃珠。在管子中加入25毫升的两摩尔氢氧化钠，然后使用摇床或转子轻轻混合两小时。

如果珠子处于悬浮状态，则在离心机中短暂地旋转珠子管，然后倒掉氢氧化钠，同时保留尽可能多的珠子。用细胞培养级水彻底清洗珠子，直到pH值是中性的，每次倒水。使用污水上的pH测试条确认中性pH值，然后用100%乙醇彻底清洗珠子，两到三次。

每次去分乙醇。干燥珠子，撒在无菌容器内形成薄层。然后将容器放在生物安全柜内，让珠子在一夜之间晾干。

轻轻敲击或摇动容器，检查珠子是否具有桑迪质地，而不会结块或剥落，以确保珠子完全干燥。将珠子添加到仪器中，使用聚丙烯网或等效材料（开口 105 微米，让珠子通过）覆盖珠子保持室的整个开口。将金属可重复使用的成像室的男性和女性两端之间的网格夹紧，然后用蜡膜将其紧密密封，紫外线对仪器进行 15 分钟的消毒。

珠子装载机设备现在可用于执行数百次装载检测。将仪器存放在由二氧化硅凝胶或其他干燥介质干燥的容器中，并将其密封。如果珠子变得彻底干燥和消毒珠子装载机，代之以新鲜的珠子，如前所示。

从细胞中取出介质，轻轻吸气所有介质，从腔室边缘周围。然后以大约 45 度角倾斜腔室，并移除中心微井中剩余的介质掉落。将珠子装载液轻轻地移到房间中央的玻璃微井上。

使用珠子装载装置轻轻分散细胞顶部的玻璃珠单层。确保珠子完全覆盖细胞。用两根手指捏住房间，用大约两英寸的力将其牢固地抬起来，大约相当于将盘子从该高度轻轻地将中间物插入房间，慢慢地输送到房间的塑料一侧。

在不干扰细胞的情况下吸气任何漂浮的珠子，整个珠子加载过程应相对较快地执行。因此，细胞在没有介质时不会干涸。然后在孵化器中孵育细胞4.5至2小时。

成像前用介质清洗细胞三次，以去除加载溶液中的珠子和多余的加载组件。使用文本手稿中的说明立即或在实验需要时对细胞进行成像。成功装珠的细胞，几乎总是把Cy3-Pa57和A488-H3K11ac标记在一起的蛋白质。

一微克质粒DNA和编码GFP和0.5微克Cy3标记蛋白也通过珠子加载表达和可视化引入细胞。40%的细胞被装上晶圆蛋白，21%的珠子装电池表达核心加载的普拉斯米德。珠子加载的细胞表示不同程度的质粒。

费舍尔比率测试的结果表明，虽然蛋白质一和二具有相似的强度分布，但每种蛋白质的分布明显小于质粒。珠子载蛋白质的水平几乎没有细胞对细胞的差异，两个同时加载的蛋白质的水平彼此高度相关。当珠子加载前、之后和珠子装货后24小时直接成像时，适当的珠子加载对人体U2OS细胞的数量或其形态几乎没有明显的影响。

珠子装量过大和敲击力过大，导致细胞损失、细胞形态不良和盖玻璃上残留的珠子群。即使细胞被认为在珠子加载过程中受到机械损伤，但细胞在适当的珠子加载室中生长和增殖。还观察到，珠子加载细胞，经历细胞分裂。

RPE1 和 HeLa 细胞线装有晶圆厂，以证明珠子加载技术的多功能性。U2OS细胞也装有Cy5-RNA 9-mer，和Cy3-DNA 28-mer在一起。当尝试此协议时，确保只向细胞添加一层珠子，因为太多的珠子会导致细胞分离。

因此，在短短的30分钟的恢复后珠子加载细胞准备成像立即或几个小时后，如果程序需要进一步的步骤，如染色，也可以在恢复期后完成。