Монослои, полученные из органоидов, рекапитулируют функцию кишечного эпителиального барьера пациента и позволяют проверить эффект терапии, направленной на усиление дисфункции у каждого пациента, для определения персонализированных стратегий лечения. Органоидные монослои обеспечивают доступ к апикальной стороне эпителия, которая является стороной, где происходит повреждение, и это нормально и доступно в органоидах, растущих как 3D-структуры. Каждый органоид индивидуален, отсюда и борьба.
Чтобы сформировать плотные монослои, используйте органоиды в фазе пролиферации и быстро переваривайте их, образуя кластеры из двух-четырех клеток. Титруйте посев клеток для каждой модели. Демонстрация процедуры будет сделана Wies Van Dooremalen, старшим научным сотрудником HUB.
Начните с покрытия мембранных вставок внеклеточным матриксом или ECM. Работая в шкафу биобезопасности, поместите мембранные вставки в опорную пластину. Разбавляют ECM 40X в ледяном холоде DPBS кальцием и магнием, затем пипетку 150 микролитров разбавленного ECM в апикальный отсек каждой вставки.
Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее одного часа. Чтобы подготовить клетки к посеву, предварительно согрейте аликвоту реагента диссоциации клеток на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Используйте два миллилитра реагента для каждой лунки шестилуночной пластины.
Перенесите культуральную пластину, содержащую органоиды, из инкубатора в шкаф биобезопасности. Обработайте органоиды, как описано в тексте рукописи, но не объединяйте несколько трубок в одну трубку. После извлечения органоидов добавляют базальную среду или БМ до 12 миллилитров и центрифугу в 85 раз G, затем аспирируют супернатант.
Заполните трубку, содержащую органоиды, до 12 миллилитров DPBS, затем пипетку вверх и вниз 10 раз, используя 10-миллилитровую пипетку. Центрифугируйте в 85 раз G в течение пяти минут при восьми градусах Цельсия и аспирируйте супернатант, не нарушая органоидную гранулу. Добавьте к органоидам предварительно нагретый реагент диссоциации клеток и повторно суспендируйте их, затем инкубируйте трубки по диагонали или горизонтально в течение пяти минут на водяной бане при 37 градусах Цельсия.
После инкубации пипетку вверх и вниз 10 раз, используя пятимиллилитровую стерильную пластиковую пипетку или пипетку P1000. Проверьте органоидную суспензию под микроскопом, чтобы увидеть, образовалась ли смесь одиночных клеток и некоторых клеточных сгустков, состоящих из двух-четырех клеток. Остановить диссоциацию клеток путем добавления до 12 миллилитров БМ с ингибитором ROCK в клеточную суспензию.
Центрифугируйте клетки, затем аспирируйте супернатант, не нарушая клеточную гранулу. При обработке одной и той же органоидной культуры в нескольких пробирках объедините клеточные гранулы перед их повторным использованием в 12 миллилитрах BM. Отфильтруйте клеточную суспензию через 40-микрометровый сетчатый фильтр, предварительно смачиваемый BM, и соберите поток в коническую трубку объемом 50 миллилитров, затем промыть сетчатый фильтр 10 миллилитрами BM и собрать поток в ту же трубку. Перенесите суспензию процеженной ячейки в две новые конические трубки по 15 миллилитров и повторите центрифугирование.
Аспирировать супернатант, не нарушая клеточную гранулу, и повторно суспендировать клетки в четырех миллилитрах IEM, дополненных 10 микромолярным ингибитором ROCK на полную культуральную пластину, используемую в качестве исходного материала. Смешайте небольшое количество клеточной суспензии в соотношении один к одному с Trypan Blue для подсчета, затем подсчитайте клетки и рассчитайте общее количество живых клеток, считая каждую отдельную ячейку небольшими сгустками. Готовят клеточную суспензию, содержащую от 3X 10 до шестой живой клетки на миллилитр IEM, дополненную 10 микромолярным ингибитором ROCK.
Чтобы засеять клетки, осторожно аспирируйте DPBS из вставок, покрытых ECM, сохраняя пластину горизонтальной. Пипетка 800 микролитров IEM, дополненная ингибитором ROCK в каждый базолатеральный компартмент и 150 микролитров клеточной суспензии, приготовленной на мембране с покрытием ECM в апикальном отсеке по каплям. Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
После того, как клетки осели на мембране, измеряйте трансэпителиальное электрическое сопротивление или TEER каждый день и визуализируйте мембранные вставки с помощью микроскопа. Чтобы освежить монослои, удалите среду из базолатеральных отсеков пластины, содержащей мембранные вставки, затем осторожно аспирируйте среду из аспиральных отсеков. Добавьте 150 микролитров свежего IEM по каплям в каждый апикальный отсек и добавьте 800 микролитров свежего IEM в каждый базолатеральный отсек.
При использовании ручного измерителя TEER очистите электрод 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе внутри шкафа биобезопасности, затем поместите электрод в трубку, содержащую BM. Подключите электрод к ручному измерителю TEER и включите переключатель функций для измерения в Омах и включения выключателя питания. Поместите короткий электрод в апикальный отсек вставки, а длинный электрод в базолатеральный отсек, не касаясь монослоя. Измерьте сопротивление в заготовочном колодце, затем в оставшихся образцах.
Промывайте электрод с БМ между образцами с различными условиями. Когда закончите, очистите электрод демиводью и 70% этанолом, затем дайте ему высохнуть на воздухе. Этот протокол использовался для извлечения органоидов кишечника и получения монослоев эпителиальных клеток.
Здесь показан монослой, который культивировался в течение восьми дней в IEM. Структура может наблюдаться при воздействии монослоев на среду дифференцировки энтероцитов или ЭДМ, в то время как монослои, подвергающиеся воздействию комбинированной среды или CDM, показывают более гладкую структуру. За формированием монослоя количественно следовало измерение TEER.
Полностью сливающийся монослой имел значение TEER приблизительно 100 Ом в квадрате, которое увеличивалось при воздействии любой дифференцирующей среды. Монослои во всех средних условиях показали более низкую кажущуюся проницаемость люциферовского желтого цвета. Секреция лизоцима подвздошными монослоями, культивируемыми в IEM, была выше, чем у монослоев, культивируемых в IEM до слияния и в течение еще четырех дней в EDM или CDM.
Монослои, культивируемые в IEM, IEM и последующих EDM, или IEM и последующих CDM, показывают различия в морфологии, которые наблюдались с окрашиваниями H &E, Ki67, MUC2 и Alcian Blue. После дифференцировки пролиферативные клетки уменьшались, в то время как экспрессия генов бокаловидных клеток и энтероцитарных маркеров увеличивалась по сравнению с тем, что наблюдалось в условиях IEM, как показано экспрессией генов LGR5, MUC2 и щелочной фосфатазы. При приготовлении монослоев важно не допускать аноикиса в органоидах после их переваривания.
Кроме того, ECM в клетках должен быть равномерно распределен на мембранах Transwell. Монослои, полученные из органоидов, позволяют оценивать транспорт молекул с использованием различных флуоресцентных субстратов в зависимости от пациента.
