Las monocapas derivadas de organoides recapitulan la función de barrera epitelial intestinal del paciente y permiten probar el efecto de las terapias dirigidas a mejorar la disfunción en cada paciente para identificar estrategias de tratamiento personalizadas. Las monocapas organoides proporcionan acceso al lado apical del epitelio, que es el lado donde se produce el daño, y es normal y accesible en organoides que crecen como estructuras 3D. Cada organoide es diferente, de ahí la lucha.
Para formar monocapas apretadas, use organoides en fase de proliferación y digiera rápidamente para formar grupos de dos a cuatro células. Titula la siembra celular para cada modelo. La demostración del procedimiento será realizada por Wies Van Dooremalen, investigador asociado senior de HUB.
Comience por recubrir los insertos de membrana con matriz extracelular o ECM. Trabajando en un gabinete de bioseguridad, coloque los insertos de membrana en la placa de soporte. Diluya el ECM 40X en DPBS helado con calcio y magnesio, luego pipetee 150 microlitros del ECM diluido en el compartimiento apical de cada inserto.
Incubar la placa a 37 grados centígrados durante al menos una hora. Para preparar las células para la siembra, precalentar una alícuota de reactivo de disociación celular en un baño de agua de 37 grados Celsius. Use dos mililitros del reactivo para cada pocillo de una placa de seis pocillos.
Transfiera la placa de cultivo que contiene los organoides de la incubadora al gabinete de bioseguridad. Procese los organoides como se describe en el manuscrito de texto, pero no agrupe varios tubos en un tubo. Después de cosechar los organoides, agregue el medio basal o BM a 12 mililitros y centrífique a 85 veces G, luego aspire el sobrenadante.
Llene el tubo que contiene los organoides con hasta 12 mililitros de DPBS, luego biple hacia arriba y hacia abajo 10 veces usando una pipeta de 10 mililitros. Centrifugar a 85 veces G durante cinco minutos a ocho grados centígrados y aspirar el sobrenadante sin perturbar la bolita organoide. Agregue el reactivo de disociación celular precalentado a los organoides y resuspónda, luego incube los tubos en diagonal u horizontalmente durante cinco minutos en el baño de agua a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces usando una pipeta de plástico estéril de cinco mililitros o una pipeta P1000. Revise la suspensión organoide bajo el microscopio para ver si se ha formado una mezcla de células individuales y algunos grupos celulares que consisten en dos a cuatro células. Detenga la disociación celular agregando hasta 12 mililitros de BM con inhibidor de ROCK a la suspensión celular.
Centrifugar las células, luego aspirar el sobrenadante sin perturbar la bolita celular. Cuando se maneje el mismo cultivo de organoides en varios tubos, agrupe los gránulos celulares antes de resuspenderlos en 12 mililitros de BM. Filtre la suspensión celular a través de un colador de 40 micrómetros prehumedecido con BM y coseche el flujo en un tubo cónico de 50 mililitros, luego lave el colador con 10 mililitros de BM y recolecte el flujo en el mismo tubo. Transfiera la suspensión de célula tensada a dos nuevos tubos cónicos de 15 mililitros y repita la centrifugación.
Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular y resuspendir las células en cuatro mililitros de IEM suplementados con 10 inhibidores micromolares de ROCK por placa de cultivo completa utilizada como material de partida. Mezcle una pequeña cantidad de suspensión celular en una proporción de uno a uno con Trypan Blue para contar, luego cuente las células y calcule el número total de células vivas, contando cada célula individual en pequeños grupos. Preparar una suspensión celular que contenga de 3X 10 a la sexta célula viva por mililitro de IEM suplementada con 10 inhibidores micromolares de ROCK.
Para sembrar las células, aspire cuidadosamente DPBS de los insertos recubiertos de ECM, manteniendo la placa horizontal. Pipete 800 microlitros de IEM suplementados con inhibidor de ROCK en cada compartimento basolateral y 150 microlitros de la suspensión celular preparados sobre la membrana recubierta de ECM en el compartimento apical hacia abajo. Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Una vez que las células se hayan sedimentado en la membrana, mida la resistencia eléctrica transepitelial o TEER todos los días y obtenga imágenes de los insertos de membrana con un microscopio. Para refrescar las monocapas, retire el medio de los compartimentos basolaterales de la placa que contiene los insertos de membrana, luego aspire cuidadosamente el medio desde los compartimentos apicales. Agregue 150 microlitros de IEM fresco gota a gota a cada compartimento apical y agregue 800 microlitros de IEM fresco a cada compartimento basolateral.
Si usa un medidor TEER manual, limpie el electrodo con etanol al 70% y déjelo secar al aire dentro del gabinete de bioseguridad, luego coloque el electrodo en un tubo que contenga BM. Conecte el electrodo al medidor TEER manual y gire el interruptor de función para medir en ohmios y encienda el interruptor de encendido. Coloque el electrodo corto en el compartimento apical del inserto y el electrodo largo en el compartimento basolateral sin tocar la monocapa. Mida la resistencia en el pozo en blanco, luego en las muestras restantes.
Lave el electrodo con BM entre muestras con diferentes condiciones. Cuando termine, limpie el electrodo con agua demi y con etanol al 70%, luego déjelo secar al aire. Este protocolo se utilizó para cosechar organoides intestinales y preparar monocapas de células epiteliales.
Aquí se muestra una monocapa que se cultivó durante ocho días en IEM. Se puede observar una estructura al exponer monocapas al medio de diferenciación de enterocitos o EDM, mientras que las monocapas expuestas a medio combinado o CDM muestran una estructura más suave. La formación de monocapas fue seguida cuantitativamente por la medición de TEER.
Una monocapa completamente confluente tenía un valor TEER de aproximadamente 100 ohmios centímetros cuadrados que aumentaba cuando se exponía a cualquiera de los medios de diferenciación. Las monocapas en todas las condiciones medias mostraron una menor permeabilidad aparente al amarillo Lucifer. La secreción de lisozima por monocapas ileales cultivadas en IEM fue mayor que la de monocapas cultivadas en IEM hasta la confluencia y durante otros cuatro días en EDM o MDL.
Las monocapas cultivadas en IEM, IEM y posterior EDM, o IEM y CDM posterior muestran diferencias en la morfología que se observaron con las tinciones H&E, Ki67, MUC2 y Alcian Blue. Tras la diferenciación, las células proliferativas disminuyeron, mientras que la expresión génica de células caliciformes y marcadores de enterocitos aumentó en comparación con la observada en condiciones IEM como lo muestra la expresión génica de LGR5, MUC2 y fosfatasa alcalina. Al preparar monocapas, es importante prevenir los anoikis en los organoides después de digerirlos.
Además, la ECM en las células debe distribuirse uniformemente en las membranas de Transwell. Las monocapas derivadas de organoides permiten la evaluación de los transportes de moléculas utilizando diferentes sustratos fluorescentes de una manera específica del paciente.
