Этот протокол предназначен для обнаружения бактерий в тканях яичников и прогнозирования их функций. Иммуногистохимическое окрашивание и секвенирование 16S рРНК были использованы для обнаружения и различения бактерий в раковых и нераковых тканях яичников in situ. Компенсационные и функциональные различия бактерий прогнозируются с помощью BoP и клеточно-генетического исследования сообществ путем реконструкции ненаблюдаемых дней.
Наш протокол направлен на извлечение бактерий из тканей яичников in situ. Он также может быть использован для обнаружения бактерий в опухолях любого рода. Основными преимуществами нашего протокола является то, что он прост и удобен, что его можно реализовать практически в каждой лаборатории.
Это также быстро, чтобы получить результаты. Во время практики в протоколе важно исключить любые бактерии вне участка опухолевых тканей. Таким образом, все процедуры в этом протоколе должны быть стерильными.
Во время операции разделите резецированные яичники на образцы тканей толщиной примерно в один сантиметр с помощью пары новых стерильных пинцетов. Избегайте прикосновений к чему-либо еще в течение всей процедуры. После разделения извлеките образец в стерильную трубку и поместите его в жидкий азот для передачи.
Сохраняйте образцы при минус 80 градусах Цельсия. Зафиксируйте ткани формалином, а затем встраивайте их парафином. Этот протокол может быть приостановлен здесь.
Ткани можно хранить при комнатной температуре для более длительного сохранения. Для выполнения дальнейших этапов разрежьте образцы на пять микрометровых последовательных секций. Затем высушите образцы.
Делают депарафин и регидратацию к образцам. Для извлечения антигена необходима 10-минутная микроволновая обработка в буфере ЭДТА. Окуните образцы в PBS, который содержит 0,3% водорода.
Перекисляют в течение 20 минут, чтобы остановить активность эндогенной пероксидазы. Выполняют антитело EMA в ядре ЛПС, в концентрации 1 на 300. И выдерживайте его в течение одной ночи при четырех градусах Цельсия.
Чтобы обнаружить бактерии, используйте набор субстрата DAP для обнаружения существования HRP. Основываясь на инструкции производителя, используйте HRP-полимер, анти-кроликово антитело. Используйте настольный концентратор, чтобы антитела полностью объединились.
Используйте PBS для устранения некомбинированных антител. Сделайте химическое окрашивание в соответствии с инструкциями производителя, а затем промойте образцы под водой. Сделайте обезвоживание к образцам.
Образцы костюмов путем подписания. И введите в качестве примера с помощью библиотеки Imaging Pro Plus Prepare на основе протокола производителя. Практикуйте паттерн праймера, который состоит из ген-специфических последовательностей и нуклеотидных последовательностей адаптера Illumina.
Чтобы амплифицировать рождаемость для области V4 бактериальных 16 на последовательностях генов рРНК, амплифицируйте шаблон из ввода образца ДНК с помощью ампликонной ПЦР. Используйте магнитные шарики Mag-Bind RxNPure Plus для удаления реакционной смеси из продукта ПЦР. Выполните индексированную амплификацию ПЦР во второй раз.
Используйте Agilent 2200 TapeStation для проверки библиотеки. Используйте систему QuantiFluor dsDNA для количественной оценки библиотеки. При цикле 600 стандартная проточная ячейка v3 производит приблизительно 100 000 парных концов.
2 раза по 300 базовых 3. Библиотеки денормализируются, объединяются в пул и секвенируются. Исходные нормы каждого образца фильтруются на основе качества секвенирования с помощью Trimmomatic.
Последовательности праймера и адаптера должны быть удалены. Последовательность чтения как с парой, так и с качествами ниже 25 должна быть сокращена. Анализ рРНК 16s с помощью программного пакета QIIME.
Соберите последовательности для формирования ОТУ с отсечкой подобия на уровне 97% Для ОТУ относительная численность должна быть рассчитана в каждой выборке. Используйте байесовский классификатор, который находится в обучающих наборах RDP для сортировки всех последовательностей. С данным OTU классификация, которая имеет основную согласованность последовательностей, присваивается ОТУ.
ОТУ выравниваются с базой данных Silva на основе информации о выборочной группе. Выполните альфа-разнообразие и анализ главных координат на основе UniFrac. Для прогнозирования соотнесения характеристик бактерий используют BugBase.
Прогнозирование функционального состава метагенома на PICRUSt. С использованием данных мониторинга и базы данных, содержащей эталонные геномы, проанализируйте различные функции среди каждой группы с помощью программного обеспечения STAMP. Используйте одно статистическое программное обеспечение для расчета результата.
Показатель статистической значимости должен быть установлен как p менее 0,05. Рассчитайте смешанные коэффициенты, которые включают возраст и паритет, с помощью t-теста Student. Рассчитайте менопаузальный статус, историю гипертонии и диабета с помощью теста Хи-квадрат.
Рассчитайте количество таксонов яичных бактерий с помощью теста Манна-Уитни U. В это исследование было включено 16 пациентов. BugBase использовался для практического анализа прогнозируемых метагеномов.
Потенциально патогенетическая и иммуногистохимия яичников с использованием антибактериального антитела ЛПС. Этот рисунок показывает бактериальное богатство и разнообразие в онкологических и контрольных группах. Выявлено путем секвенирования 16S рРНК.
На рисунках наблюдается видовой индекс. Индекс Chao1, индекс ACE, индекс Шеннона, индекс ровности, индекс Симпсона соответственно. Относительное изобилие типов и 12 наиболее распространенных видов бактерий в образцах яичников показано на этом рисунке.
Рисунок A, B, C и D. Означает относительное обилие панели в яичниках пациенток контрольной группы и группы рака яичников. Относительное обилие двенадцати наиболее распространенных видов бактерий в яичниках контрольных пациенток и группе рака яичников. Это самые распространенные вещества, сгруппированные с использованием PCoA и относительного изобилия Anoxynatronum sibiricum и Methanosarcina vacuolata.
На рисунке A показаны наиболее распространенные, которые были сгруппированы с использованием PCoA. PC1 и PC2 построены по осям x и Y. Красный блок равен образцу в группе рака яичников.
Синий круг равен образцу в контрольной группе. Образцы из группы рака яичников могут быть отделены от других образцов в контрольной группе. На рисунке B показаны наиболее распространенные вещества, которые были сгруппированы с использованием PCoA.
PC1 и PC2 построены по осям x и y. Красный блок равен образцу в группе рака яичников. Синий сплошной круг равен образцу от пациентки с миомой матки.
А синий полый круг равен образцу пациентки с аденомиозом матки. На рисунке С показано относительное изобилие Anoxynatronum sibiricum. Рисунок D - Methanosarcina vacuolata.
Этот показатель является анализом BugBase прогнозируемой метагеномики. Потенциально патогенетический и окислительный стрессоустойчивый фенотип яичников в группе рака был сильнее, чем у контрольной группы. Эта цифра существенно отличается от пространства путей KEGG между онкологической и контрольной группами по анализу PICRUSt.
Когда мы получаем наши образцы, требуется пара новых стерильных пинцетов. Обратите внимание на потенциальное загрязнение образцов. Именно бактерии вне участка опухолевых тканей могут сильно влиять на разрешение.
Предпочтительнее установить контрольную группу на каждый шаг. Для того, чтобы уменьшить эффект потенциального загрязнения.
