Este protocolo é projetado para descobrir bactérias em tecidos ovarianos e prever suas funções. A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento de rRNA 16S foram usados para descobrir e distinguir bactérias em tecidos ovarianos cancerígenos e não cancerosos in situ. A compensação e as diferenças funcionais das bactérias são previstas pelo uso de BoPs e investigação celular-genética das comunidades por meio da reconstrução de dias não observados.
Nosso protocolo visa extrair bactérias de tecidos ovarianos in situ. Também pode ser usado para descobrir bactérias em tumores de qualquer tipo. As principais vantagens do nosso protocolo são que é fácil e conveniente, que pode ser realizado em quase todos os laboratórios.
Também é rápido obter os resultados. Durante a prática no protocolo, é importante excluir qualquer bactéria fora do local tecidos tumorais. Assim, todos os procedimentos neste protocolo precisam ser estéreis.
Durante a cirurgia, separam os ovários ressecados em amostras de tecido de aproximadamente um centímetro de espessura com um par de novas pinças estéreis. Evite tocar em qualquer outra coisa durante todo o procedimento. Após a separação, remova a amostra em um tubo estéril e coloque-a em nitrogênio líquido para transmissão.
Preservar amostras em menos 80 graus Celsius. Fixar tecidos por formalina, e depois incorporá-los por parafina. Este protocolo pode ser pausado aqui.
Os tecidos podem ser mantidos em temperatura ambiente para maior preservação. Para operar outras etapas, corte as amostras em cinco seções de série de micrômetros. Então, seque as amostras.
Faça de parafina e reidratação para as amostras. Para recuperar o antígeno, é necessário um tratamento de micro-ondas de 10 minutos no buffer EDTA. Mergulhe as amostras em PBS que contém 0,3% de hidrogênio.
Peroxidize por 20 minutos para parar a atividade peroxidase endógena. Realize o anticorpo EMA no núcleo LPS, com uma concentração de 1 sobre 300. E mantê-lo por uma noite a quatro graus Celsius.
Para descobrir as bactérias, empregue um kit de substrato DAP para detectar a existência de HRP. Baseando-se nas instruções do fabricante, use polímero HRP, anticorpo anti-coelho. Use o concentrador de mesa para deixar o anticorpo totalmente combinado.
Use PBS para eliminar anticorpos não combinados. Faça sua coloração química de acordo com as instruções do fabricante e depois lave as amostras debaixo d'água. Faça desidratação nas amostras.
Terno amostras assinando. E insira como uma amostra usando a imagem Pro Plus Prepare biblioteca com base no protocolo do fabricante. Pratique o padrão primer, que consiste nas sequências específicas do gene e nas sequências de nucleotídeos de saliência do adaptador de Illumina.
Para amplificar as taxas de natalidade para a região V4 de 16 bactérias em sequências genéticas rRNA, amplifique o modelo da entrada da amostra de DNA usando amplicon PCR. Use contas magnéticas Mag-Bind RxNPure Plus para remover a mistura de reação do produto PCR. Realize a amplificação pcr indexada pela segunda vez.
Use o Agilent 2200 TapeStation para verificar a biblioteca. Use o sistema DSDNA QuantiFluor para quantificar a biblioteca. Com um ciclo de 600, a célula de fluxo padrão V3 produz aproximadamente 100.000 extremidades emparelhadas.
2 vezes 300 base 3. Bibliotecas são desnormalizadas, agrupadas e sequenciadas. As taxas brutas de cada amostra são filtradas com base na qualidade de sequenciamento pela Trimmomatic.
As sequências de primer e adaptador devem ser removidas. Leituras de sequência com par e qualidades inferiores a 25 devem ser encurtadas. Analise o rRNA 16s pelo pacote de software QIIME.
Reúna sequências para formar OTUs com um corte de similaridade em 97% Para os OTUs, a abundância relativa deve ser calculada em cada amostra. Empregue um classificador bayesiano, que está no conjunto de treinamento RDP para classificar todas as sequências. Com dado OTU, uma classificação que tem a maior coerência das sequências é atribuída às OTUs.
As OTUs estão alinhadas ao banco de dados de Silva, baseando-se em informações de grupo amostral. Realize a diversidade alfa e a análise principal de coordenadas baseada na UniFrac. Para prever a apresentação das características das bactérias, use o BugBase.
Prever a composição funcional de um metagenome no PICRUSt. Com o uso de dados de monitoramento e um banco de dados contendo genomas de referência, analise as diferentes funções entre cada grupo com a ajuda do software STAMP. Use um software estatístico para calcular o resultado.
A indicação de significância estatística deve ser definida como p inferior a 0,05. Calcular fatores de confusão, que incluem idade e paridade, pelo teste t do Aluno. Calcule o estado da menopausa, histórico de hipertensão e diabetes pelo teste qui-quadrado.
Calcule o número de taxas de bactérias do ovário pelo teste mann-whitney u. 16 pacientes foram inscritos neste estudo. BugBase foi usado para praticar análises de metagenomes previstos.
A potencialmente patogenética e imunohistoquímica dos ovários usando anticorpo LPS antibacteriano. Este número mostra riqueza bacteriana e diversidade nos grupos de câncer e controle. Revelado pelo sequenciamento de rRNA 16S.
Os números são de índice de espécies observados. Índice Chao1, índice ACE, Índice Shannon, Índice de Evenness, Índice Simpson, respectivamente. A abundância relativa de filos e as 12 espécies bacterianas mais abundantes nas amostras ovarianas é mostrada nesta figura.
Figura A, B, C e D.Significa a abundância relativa do painel nos ovários dos pacientes do grupo controle e do grupo de câncer de ovário. As abundâncias relativas das doze espécies de bactérias mais abundantes nos ovários dos pacientes de controle e do grupo de câncer de ovário. Este é o mais comum, agrupado usando PCoA e a abundância relativa de Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata.
A Figura A mostra os mais comuns, que foram agrupados usando PCoA. PC1 e PC2 são plotados em x e no eixo y. O bloco vermelho é igual à amostra do grupo de câncer de ovário.
O círculo azul é igual a uma amostra no grupo de controle. As amostras do grupo de câncer de ovário podem ser separadas de outras amostras do grupo controle. A Figura B mostra os mais comuns que foram agrupados usando PCoA.
PC1 e PC2 são plotados no eixo x e y. O bloco vermelho é igual a uma amostra no grupo de câncer de ovário. O círculo azul sólido é igual a uma amostra do paciente com mioma uterino.
E o círculo oco azul é igual a uma amostra de um paciente com adenomiose uterina. A Figura C mostra a abundância relativa de Anoxynatronum sibiricum. A figura D é a tumocina vacuolata.
Este número é a análise bugbase da metagenômica prevista. O fenótipo potencialmente patogenético e oxidativo de tolerância ao estresse dos ovários no grupo do câncer foi mais forte do que o do grupo controle. Este número é significativamente diferente do espaço de caminho KEGG entre os grupos de câncer e controle pela análise PICRUSt.
Quando tivermos nossas amostras, um par de novas pinças estéreis são necessárias. Preste atenção à contaminação potencial das amostras. Que as bactérias fora do local podem afetar muito a resolução.
Definir o grupo de controle para cada etapa é preferível. A fim de reduzir o efeito da contaminação potencial.
