Эти методы могут быть использованы для характеристики нейровоспалительных и гемодинамических реакций на черепно-мозговую травму в рамках многомерного системного анализа с использованием частичной регрессии наименьших квадратов. Эти методы используются, чтобы дать более целостное представление о реакции мозга на травму. Чтобы вызвать травму, подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги у анестезированной мыши и поместите мышь в положение лежа на центре тонкой мембраны.
Используя обе руки, чтобы удерживать ткань, закрепите хвост мыши под большим пальцем и расположите голову мыши под направляющей трубкой. Когда мышь находится в положении, нацеливаясь на удар между задней частью глаз и передней частью ушей, опустите болт с верхней части направляющей трубки на спинной аспект головы мыши. При ударе мышь прорвется через ткани, что позволит быстро ускорить голову вокруг шеи.
После травмы позвольте мыши восстановиться в положении лежа на спине на согревающей подушке с температурой 37 градусов цельсия. После двухминутного периода стабилизации осторожно расположите датчик DCS над правым полушарием черепа мыши, так что верхний край оптического датчика выровняется с задней частью глаза, а сторона датчика выстроится вдоль средней линии. Положите руку на датчик, чтобы защитить его от комнатного света и получить пять секунд данных.
Затем переместите датчик над левым полушарием и получите пять секунд данных левого полушария. Чтобы оценить производство мультиплексированных цитокинов и фосфобелков, добавьте 150 микролитров смешанного буфера лизиса примерно на три миллиграмма собранной ткани мозга животных. И используйте 1000-микролитровый наконечник пипетки, чтобы механически тритурировать ткань от 15 до 20 раз.
Поместите гомогенизированные образцы на ротатор в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, прежде чем собирать обломки тканей путем центрифугирования. Перенесите супернатанты в новые пробирки и центрифугируйте образцы, чтобы удалить оставшийся осадок. Перенесите супернатанты в новые пробирки и определите концентрацию белка методом анализа BCA в соответствии со стандартными протоколами.
Подготовьте 25 микролитров каждого образца при оптимальной концентрации белка, определенной анализом линейного диапазона в новых пробирках. Использование пробного буфера позволяет нормализовать общий объем каждого образца до 25 микролитров. Чтобы подготовить пробирную пластину, добавьте 200 микролитров промывочного буфера в каждую лунку 96-луночной пластины и встряхните пластину на шейкере в течение 10 минут со скоростью 750 оборотов в минуту.
В конце инкубации наполните буфер для стирки и постучите тарелку по бумажному полотенцу, чтобы удалить остатки. Затем добавьте 25 микролитров пробирного буфера в каждую скважину, а затем 25 дополнительных микролитров буфера в фоновые скважины. Добавьте 25 микролитров разбавленных образцов в соответствующие пробоотборные скважины и вихрьте через мультиплексированные магнитные шарики в течение одной минуты, прежде чем добавить 25 микролитров тщательно подвешенных шариков в каждую лунку.
Когда все бусины будут добавлены, запечатайте пластину пластинчатым герметиком и накройте пластину фольгой для ночной инкубации с встряхиванием при двух-восьми градусах Цельсия. На следующее утро поместите пластину на магнитный сепаратор, убедившись, что скважины выровнены с магнитами. Через две минуты декантируйте содержимое скважины пластиной, все еще прикрепленной к магнитному сепаратору, и добавьте 200 микролитров промывочного буфера в каждую скважину.
После того, как он будет встряхиваться в течение двух минут, поместите пластину на магнитный сепаратор в течение двух минут. Затем декантируйте содержимое скважины пластиной, все еще прикрепленной к магнитному сепаратору, и промывайте пластину свежими 200 микролитрами промывочного буфера на скважину, как только что было продемонстрировано. После второй промывки добавляют 25 микролитров детектирующего антитела на лунку и повторно покрывают фольгой для одночасовой инкубации со скоростью 750 оборотов в минуту при комнатной температуре.
В конце инкубации добавляют в каждую лунку 25 микролитров стрептавидина фикоэритрина и возвращают пластину в шейкер еще на 30 минут при комнатной температуре. В конце инкубации поместите пластину на магнитный сепаратор на две минуты, прежде чем декантировать содержимое скважины. Дважды вымойте пластину 200 микролитрами свежего промывочного буфера на каждую промывку и добавьте 75 микролитров соответствующей приводной жидкости в каждую скважину.
Затем повторно подвешивайте шарики на пластинчатом шейкере в течение пяти минут при комнатной температуре и считывайте пластины на анализаторе в соответствии с инструкциями производителя. В этом анализе мозговой кровоток измеряли с помощью диффузной корреляционной спектроскопии через четыре часа после последней травмы. Затем можно определить индекс мозгового кровотока и средний индекс мозгового кровотока для каждого полушария.
Линейный анализ диапазона может быть проведен для определения соответствующей массы загрузки белка до сбора данных из всех образцов. Данные о цитокинах могут быть получены путем вычитания фоновых измерений из данных образца, а затем вычисления данных Z-оценки для каждого анолита. Частичная регрессия наименьших квадратов может быть проведена с использованием маркера активации микроглии фагоцитов или другой переменной, представляющей интерес, в качестве переменной ответа, а измерения цитокинов в качестве предикторных переменных.
Вращение Varimax может быть выполнено для максимизации ковариации данных по латентной переменной, с измерениями маркера активации. Высокие нагрузочные веса в латентной переменной соответствуют цитокиновым экспрессиям, наиболее связанным с высокой экспрессией маркера активации. Линейные регрессии между маркером активации и цитокинами показывают, что цитокины с наибольшим весом нагрузки в латентной переменной также были статистически значимыми для этого анализа.
Хотя мы сосредоточили этот протокол на черепно-мозговой травме, эти методы широко обобщаются для изучения множества патологических состояний, которые влияют на мозг. Мы используем эти методы, чтобы помочь нам определить поддающиеся лечению цели для модуляции в будущих экспериментах для установления причинно-следственных механистических связей и, в конечном счете, с целью разработки новых терапевтических стратегий для легкой черепно-мозговой травмы.
