Esses métodos podem ser usados para caracterizar respostas neuroinflamatórias e hemodinâmicas à lesão cerebral como parte de uma análise do sistema multivariado usando regressão parcial de quadrados. Essas técnicas são usadas para dar uma visão mais holística da resposta do cérebro à lesão. Para induzir uma lesão, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato anestesiado e coloque o rato na posição propensa no centro de uma membrana fina.
Usando ambas as mãos para segurar o tecido ensinado, fixar a cauda do rato sob um polegar e posicionar-se para a cabeça do mouse sob o tubo guia. Quando o mouse estiver em posição, visando o impacto entre a parte de trás dos olhos e a frente das orelhas, solte o parafuso do topo do tubo guia sobre o aspecto dorsal da cabeça do mouse. Com o impacto, o rato romperá o tecido, permitindo uma aceleração rápida da cabeça sobre o pescoço.
Após a lesão, permita que o rato se recupere na posição supina em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus. Após um período de dois minutos de estabilização, descanse suavemente o sensor DCS sobre o hemisfério direito do crânio do mouse, de tal forma que a borda superior do sensor óptico se alinha com a parte de trás do olho e a lateral do sensor se alinha ao longo da linha média. Desarme a mão sobre o sensor para protegê-lo da luz do quarto e adquirir cinco segundos de dados.
Em seguida, reposicione o sensor sobre o hemisfério esquerdo e adquira cinco segundos de dados do hemisfério esquerdo. Para avaliar a produção de citocina multiplexada e proteína fosfo, adicione 150 microliters de tampão de lise mista por aproximadamente três miligramas de tecido cerebral animal colhido. E use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter para triturar mecanicamente o tecido 15 a 20 vezes.
Coloque as amostras homogeneizadas em um rotador por 30 minutos a quatro graus Celsius antes de coletar os detritos teciduais por centrifugação. Transfira os supernantes em novos tubos e centrifufique as amostras para remover qualquer precipitado restante. Transfira os supernantes para novos tubos e determine a concentração de proteínas pelo ensaio BCA de acordo com os protocolos padrão.
Prepare 25 microliters de cada amostra na concentração de proteína ideal, conforme determinado pela análise linear da faixa em novos tubos. Utilizando tampão de ensaio para normalizar o volume total de cada amostra para 25 microliters. Para preparar uma placa de ensaio, adicione 200 microliters de tampão de lavagem a cada poço de uma placa de 96 poços e agite a placa em um agitador por 10 minutos a 750 rotações por minuto.
No final da incubação, decante o tampão de lavagem e bata a placa em uma toalha de papel para remover qualquer resíduo. Em seguida, adicione 25 microliters de tampão de ensaio a cada poço, seguido por 25 microliters adicionais de buffer aos poços de fundo. Adicione 25 microlitres das amostras diluídas aos poços de amostra apropriados e vórtice através de contas magnéticas multiplexadas por um minuto, antes de adicionar 25 microliters das contas completamente suspensas a cada poço.
Quando todas as contas tiverem sido adicionadas, sele a placa com um selador de placa e cubra a placa com papel alumínio para uma incubação durante a noite com agitação de dois a oito graus Celsius. Na manhã seguinte, coloque a placa em um separador magnético, certificando-se de que os poços estejam alinhados com os ímãs. Após dois minutos, decante o conteúdo do poço com a placa ainda presa ao separador magnético e adicione 200 microliters de tampão de lavagem a cada poço.
Depois de mantê-lo tremendo por dois minutos, coloque a placa no separador magnético por dois minutos. Em seguida, decante o conteúdo do poço com a placa ainda presa ao separador magnético e lave a placa com um novo 200 microliters de tampão de lavagem por bem, como acabou de demonstrar. Após a segunda lavagem, adicione 25 microliters de anticorpo de detecção por poço e cubra com papel alumínio para uma incubação de uma hora a 750 revoluções por minuto à temperatura ambiente.
No final da incubação, adicione 25 microliters streptavidin phycoerythrin a cada poço e devolva a placa ao agitador por mais 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, coloque a placa no separador magnético por dois minutos antes de decantar o conteúdo do poço. Lave a placa duas vezes com 200 microliters de tampão de lavagem fresco por lavagem e adicione 75 microliters do fluido de acionamento apropriado a cada poço.
Em seguida, suspenda novamente as contas do agitador da placa por cinco minutos em temperatura ambiente e leia as placas do analisador de acordo com as instruções do fabricante. Nesta análise, o fluxo sanguíneo cerebral foi medido com espectroscopia de correlação difusa quatro horas após a última lesão. O índice de fluxo sanguíneo cerebral e o índice médio de fluxo cerebral para cada hemisfério podem então ser determinados.
Uma análise de alcance linear pode ser conduzida para determinar uma massa de carregamento de proteínas apropriada antes da coleta de dados de todas as amostras. Os dados de citocinas podem ser preparados subtraindo as medições de fundo dos dados da amostra e, em seguida, computando dados de pontuação Z para cada anolito. A regressão parcial de quadrados pode ser conduzida utilizando-se um marcador de ativação microglial fagocite ou outra variável de interesse como variável de resposta, e as medidas de citocinas como as variáveis preditoras.
A rotação Varimax pode ser realizada para maximizar a covariância dos dados na variável latente um, com as medidas do marcador de ativação. Pesos de carga elevados em variável latente correspondem às expressões de citocina mais associadas à alta expressão do marcador de ativação. Regressões lineares entre o marcador de ativação e citocinas ilustram que as citocinas com maiores pesos de carga em variáveis latentes também foram estatisticamente significativas para esta análise.
Embora tenhamos focado este protocolo em lesões cerebrais traumáticas, esses métodos são amplamente generalizáveis ao estudo de uma infinidade de condições patológicas que afetam o cérebro. Usamos essas técnicas para nos ajudar a identificar alvos tratáveis para modular em experimentos futuros para estabelecer relações mecanicistas causais e, finalmente, com o objetivo de desenvolver novas estratégias terapêuticas para lesões cerebrais traumáticas leves.
