Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo

Этот протокол описывает благородный и простой метод для создания сетчатой формы инженерии сердечных тканей, полученных из человеческих индуцированных частей тела и STEM клеток, полученных сердечных клеток. Гибкость геометрии тканей и масштабируемость функции сохранившихся тканей являются основными преимуществами этой техники. Имплантированная форма сетки ECTs может восстановить сердечную структуру и функцию в модели инфаркта миокарда крысы.

Подтверждение его осуществимости для использования в сердечной регенеративной терапии. Эти методы требуют воспроизводимой обработки стволовых клеток человека и навыков культуры тканей для последовательных результатов. Начните с резки вылеченного листа PDMS до соответствующего размера, чтобы позволить листу быть связаны с силиконовым клеем, чтобы изготовить 21 на 20,5 миллиметр прямоугольный лоток с семи миллиметров длиной 0,5 миллиметра в ширину и 2,5 миллиметра высоких прямоугольных столбов в шахматном положении.

Горизонтальное расстояние между двумя линиями столбов должно быть 2,5 миллиметра. Автоклав лоток при 120 градусах по Цельсию в течение 20 минут, прежде чем покрытие формы с 1%Poloxamer 407 в PBS в течение одного часа. Затем тщательно промыть плесень с PBS и поместить плесень в один колодец из шести хорошо пластины.

Для анализа линии, объединить клетки из кардиомиоцитов плюс эндотелиальных и сосудистых протоколов фрески клеток. Так что окончательная концентрация фресок составляет от 10 до 20% в общей численности клеток от шести раз от 10 до шести ячеек на конструкцию. Смешайте 133 микролитров растворимого растворимого раствора крысиного хвоста и 17 микролитров Alkali Buffer до 17 микролитров 10X Minimum Essential Medium на льду.

Затем добавьте 67 микролитров мембранной матрицы подвала в раствор коллагена. Далее, центрифуга клеток и повторно гранулы в 167 микролитров высокой глюкозы Dulbecco минимальная основная среда дополнена фетальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков. Смешайте клетки на матричном растворе на льду.

Затем тщательно залить 400 микролитров клеточной матричной подвески на poloxamer 407 покрытием PDMS ткани плесени. Инкубировать смесь матрицы клеток в стандартном инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение 60 минут. Когда ткань сформировалась, тщательно замочите плесень с четырьмя миллилитров ЭСТ культуры среды и вернуть пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 14 дней.

Перед имплантацией ЭСТ вы стерилизовали тонкие типсы, чтобы тщательно удалить ЭСТ с погрузочных столбов. Ткань формы могут быть изготовлены с различными шаблонами, после длины и после интервала для создания различных окончательных геометрий ЭСТ. Для этого анализа была использована форма с семимиллиметровыми столбами с интервалом в 2,5 миллиметра.

Poloxamer 407 предотвращает присаделение клеток в форму и позволяет сформировать характерную структуру сетки, после быстрого уплотнения геля в течение 14 дней. Структура поддерживается даже после того, как ЭСТ высвобождается из формы. Конструкция изготовленной ткани имеет ширину около 1,5 см и толщину 0,5 миллиметра.

А ширина каждого пучка в сетке составляет в среднем около 0,5 миллиметра. Можно создать 3 сантиметра окончательной ширины сетки ЭСТ, содержащей 24 миллионов клеток из четырех раз больше плесени с той же шахматной конструкции поста. Эта большая сетка ЭСТ также может быть легко удалена из формы и генерирует локальный акт силы, эквивалентный меньшей сетке ЭСТ.

Важно, чтобы залить смесь матрицы клеток равномерно в форму ткани без генерации пузырьков, чтобы предотвратить чувство дефектов в окончательном гель. Функциональная характеристика подрядчика. и четвертой частоты отношения могут быть выполнены с помощью встроенных систем.

Нашей конечной целью является перевод парадигм ЭСТ в клиническую терапию, в которой используются крупные доклинические исследования на животных.