Протокол сочетает в себе способность генерировать типы сердечно-сосудистых клеток человека с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и универсальную технику для генерации бьющихся сердечных сфероидов менее чем за 72 часа. Эти сердечные сфероиды могут быть использованы для моделирования заболеваний и тестирования лекарств. Одним из основных преимуществ этой легкой техники является то, что можно генерировать почти 1000 бьющихся сердечных сфероидов в стандартной 12-луночной пластине.
И самое главное, каждый сердечный сфероид может быть проанализирован на его сократительную функцию с использованием метода визуализации. После расплавления агарозы в микроволновой печи поместите ее в шкаф биобезопасности и дайте остыть в течение трех минут. Пипетка 700 микролитров расплавленной агарозы и добавьте ее в силиконовый микроформовку массива девять на девять, заботясь о том, чтобы избежать образования пузырьков.
Осторожно поместите плесень на предварительно холодную ледяную глыбу, чтобы ускорить продолжительность агарозы. Как только агароза станет полупрозрачной, осторожно согните края микроформовки, чтобы потерять реплику агарозы, и аккуратно очистите реплику со всех сторон, чтобы отделить ее от силиконовой микролили. Переложите лоток с микротизой агарозы, содержащий 81 круглое углубление, в стерильную 12-луночную пластину, затем добавьте два миллилитра PBS в лоток для микротизирования агарозы и осмотрите его под микроскопом на наличие каких-либо захваченных пузырьков или лунок неправильной формы.
Погрузите лоток с агарозой в два миллилитра 70% этанола на ночь, а затем УФ-обработку в шкафу биобезопасности на один час. Удалите 70% этанола и дважды промыть дистиллированной водой и один раз двумя миллилитрами PBS. После того, как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные кардиомиоцитами, сердечными фибробластами и эндотелиальными клетками, будут подсчитаны после трипсинизации и нейтрализации, поместите клеточные суспензии на лед.
В новой трубке смешайте индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные из кардиомиоцитов, сердечных фибробластов и эндотелиальных клеток. Затем удалите PBS из колодца и камеры посева клеток, не касаясь углублений, и добавьте 200 микролитров клеточной суспензии по каплям. Позвольте клеткам осесть при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа в течение двух часов.
Добавьте микротканевую среду, окружающую агарозную плесень, чтобы покрыть поверхность внутренней камеры. Через 24 часа наблюдайте за самосборными и компактными сфероидами в круглых углублениях. Меняйте среду каждые два дня для поддержания сфероидов.
Как правило, через 48 часов может наблюдаться спонтанное биение сфероидов. Культивируйте отдельные типы клеток отдельно на матричной среде базальной мембраны или на слайдах камеры с желатиновым покрытием. Осторожно вымойте сердечные микроткани из круговых углублений и соберите их в 15-миллилитровую летную трубку.
Аспирируйте среду и промывайте клетки или микроткани одним миллилитром PBS. Затем зафиксируйте клетки или микроткани с помощью буфера фиксации, содержащего 4,2% PFA, и инкубируйте при комнатной температуре. Аспирировать PFA и инкубировать клетки или микроткани одним миллилитром пермеабилизирующего раствора.
Затем аспирировать раствор и промыть двумя-тремя миллилитрами PBS. Добавьте от 500 до 1000 микролитров блокирующего раствора в клетки и инкубируйте в течение по меньшей мере одного часа для слайдов камеры и в течение трех-четырех часов для микротисс. Инкубируют образцы с конъюгированными антителами в блокирующем растворе в течение одного часа для камерных слайдов и в течение ночи при четырех градусах Цельсия для сердечных микротизов.
Промывайте камеру три раза 500 микролитрами 0,1% Tween 20, с пятиминутной продолжительностью между каждой стиркой, затем выполните окончательную стирку с PBS. Промывайте сердечные микроткани пять раз двумя миллилитрами 0,1% Tween 20, с продолжительностью 20 минут между каждой стиркой. Затем выполните заключительную стирку в течение дополнительных 20 минут.
Инкубируйте клетки или микроткани с помощью DAPI перед конфокальной микроскопией, затем осторожно перенесите сердечные микротизы в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю чашку и добавьте PBS для погружения микроткани. Смывайте микроткани из круглых углублений со средним с помощью широкого или одного миллилитра пипетки в 15-миллилитровую хроническую трубку и дайте им осесть. Затем аспирировать среду и промыть одним миллилитром PBS.
Добавьте от 200 до 300 микролитров буфера переваривания ферментов и инкубируйте в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия. Затем аккуратно перемешайте микротизы в течение одной минуты и повторите инкубацию. После инкубации энергично перемешайте микроткани с обычным кончиком пипетки в один миллилитр, чтобы переварить его в отдельные клетки.
Получают мутную клеточную суспензию и немедленно нейтрализуют клеточную суспензию пятью миллилитрами среды, содержащей 5% FBS. Процедите клеточную суспензию через 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр и подсчитайте общее количество клеток. Центрифугируйте одноэлементную суспензию в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в буфере связывания аннексина с FITC Annexin V и йодидом пропидия, или красителем для исключения мертвых клеток TO-PRO-3, и инкубировать в течение 10 минут на льду. После инкубации добавляют 300 микролитров буфера связывания аннексина к клеточной суспензии и переносят его в трубку FACS с круглым дном для анализа проточной цитометрии. Очищенные индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и сердечные фибробласты были визуализированы с использованием фазово-контрастной микроскопии.
Чистоту различных типов клеток определяли с помощью иммуноокрасления и проточной цитометрии. Тропонин Т использовался в качестве маркера кардиомиоцитов, и была достигнута чистота более 90%. Молекула адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов CD31 и виментин использовались в качестве маркеров для эндотелиальных клеток и сердечных фибробластов и указывали чистоту более 98 и 96% соответственно.
Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что кардиомиоциты были самыми тяжелыми и занимали центр микростисуз, тогда как эндотелиальные клетки перемежались по всей микроткани, а сердечные фибробласты преимущественно занимали периферию. Переваривание микротиз с использованием этого темпа и Liberase TL привело к очень жизнеспособным пропорциям клеток с меньшим количеством апоптотических клеток после двух недель в культуре. Одночасовое воздействие сердечной микроткани приводит к высокой концентрации доксорубицина, индуцированной дозозависимой кардиотоксичностью.
Сократимость микротканей и движение векторов создали псевдотепловую карту, которая проиллюстрировала средний профиль сокращения по всему микротизнесу. Сократительное движение сердечных микротизюй генерировало положительные пики, которые измерялись как скорость сокращения, скорость релаксации и скорость биения, которая была рассчитана как время между двумя циклами сокращения. Сократимость сердечных микротизов была последовательной в течение четырех недель в культуре.
Нагревание клеток является одним из наиболее важных шагов в этом конкретном протоколе, где необходимо позаботиться о том, чтобы осторожно распределять клеточную суспензию по каплям в массив агарозы для равномерного распределения внутри микролунок и предотвращения переполнения. Используя оптимизированный протокол излучения этих микротизлов, можно было бы подвергнуть их высокопроизводительным технологиям секвенирования, таким как одноклеточный РНК-seq или одноклеточный ATAC-seq, чтобы понять паттерны экспрессии генов, специфичные для клеток, возникающие из-за различных условий лечения.
