Этот протокол использует лазерное микроперепись и секвенирование РНК для анализа дифференциального экспрессии мРНК внутриопухолустной неоднородности, таких как области накопления мезенхимальных клеток или области вторжения опухоли. Этот метод был оптимизирован для сохранения гистологии тканей хорошего качества и целостности РНК, чтобы облегчить приобретение высококачественных образцов лазерного микродиссекции. Этот метод чувствителен и воспроизводим.
Он может быть использован для изучения морфологии опухоли и неоднородности в различных моделях опухолей. Лазерная микроперемидание замороженных опухолевых тканей головного мозга является экономически эффективным, надежным методом изоляции дискретных анатомических областей популяций клеток от опухолевых тканей для изучения их молекулярных профилей. LMD можно использовать для того чтобы приобрести углубленное механистическое знание о молекулярных событиях которые происходят во время прогрессирования тумора, и смогли показать новые терапевтические цели.
Виво биолюминесценции опухоли мыши бремя достигает сигнала от одного раза 10 до шести и один раз от 10 до 7 фотонов. Промыть кислородом раствор тирода через кровеносную систему усыпанной опухоленосной мыши до тех пор, пока печень и легкие не будут полностью очищены от крови. Продолжить perfusing животное с 30% растворяемой сахарозой растворяется в растворе тирода в течение еще 15 минут.
Чтобы оценить успех перфузии, подтвердите, что шея, хвост и ноги являются жесткими в конце циркуляции. Затем урожай мозга в соответствии со стандартными протоколами и хранить мозг на ночь в свежем 30% раствор сахарозы. Чтобы подготовиться к криоконсервации, заполните банку холодным изопентаном-2-метилбутаном и поместите банку в контейнер, наполненный жидким азотом.
В то время как растворитель охлаждается, пятно мозга сухой на листе фильтровальной бумаги и поместите мозг в помечены Cryomold. Тщательно примерно при пяти миллилитров оптимальной температуры резки среды к центру Cryomold и место мозга в форму в желаемой ориентации. Используя чистые типсы, быстро поместите Cryomold в охлажденный изопентан-2-метилбутан в течение 30 до 40 секунд.
После того, как режущая среда затвердевает, перенесите Cryomold на сухой лед и оберните Cryomold и оснастки замороженных тканей мозга в алюминиевой фольге для минус 80 градусов по Цельсию хранения. Чтобы приобрести замороженные участки опухолевых тканей головного мозга, сначала установите температуру криостата между минус 20 и минус 24 градусами по Цельсию, и поместите блок образца в криостат-камеру на 30-60 минут. В то время как образец equilibrating, очистить камеру и нож держатель со 100% этанола и спрей раздел кисти с RNase очистки раствора.
Когда образец будет готов, удалить плесень и использовать свежие резки среды прикрепить замороженные ткани блока к образцу диска криостата. Поместите блок в держатель диска и выровнять блок с лезвием ножа. Приобрети 10 микрометровых секций мозга с помощью одной из кистей без Рнкса, чтобы тщательно сгладить и разнести кусочки ткани на режущей поверхности.
Чтобы смонтировать секции ткани мозга на слайды, плавно нажмите положительно заряженную сторону помеченного RNase-бесплатного пен-стеклянного слайда на секцию и поместите слайд в ящик для хранения внутри камеры. Когда все слайды будут собраны, поместите ящик для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы растворить режущей среды до лазерного микро рассечения, погрузите слайды в 30-секундный последовательный нисходящий этанол погружения следуют кристально фиолетовый раствор окрашивания в течение 20 секунд и пять секунд в 0,5%eosin Y решение.
В конце инкубации эозин Y используйте фильтровальную бумагу, чтобы заблокировать слайды сухими и обезвоживать слайды в последовательных восходящих погружениях этанола. После 60-секундного погружения этанола, промыть слайды в контейнере с ксиленом в течение трех минут. Затем высушите горки на поверхности, свободной от RNase, при комнатной температуре в течение 10 секунд, прежде чем монтировать образцы в монтажной среде, приготовленной с помощью воды без RNase.
Через 10-20 секунд перенесите слайды на платформу микродиссекции микроскопа. Для захвата лазером микроперегибатель, включите питание перед включением лазера. Затем включите контроллер микроскопа в компьютере и запустите программное обеспечение для микродиссекции захвата лазера.
В панели управления микроскопом выберите увеличение в 10 раз. Под лазерным управлением установите лазерные параметры для вскрытия тканей и выберите лазерную частоту 120 герц и лазерный ток 100% Для точного лазерного микроперемечения установите скорость до 10 и установите диафрагму до 10 микрометров. Затем установите мощность до 53.
Загрузите коллектор тканей, который захватит ткань после раздела и нажмите на вторую кнопку разгрузки. Замените пустой коллектор на DNase и Rnase-бесплатные 0,5 миллилитровые плоскоголовые трубки PCR, содержащие 30 микролитров буфера лиза на трубку. Верните коллектор к машине и нажмите продолжить работу.
Загрузите обработанный образец на микроскоп и нажмите Unload в программном обеспечении для микропересмешки лазера. Вверх по образцу на держатель слайда и поместите держатель слайда на сцену. Нажмите Продолжить продолжить и выбрать Draw Cut в окне Cut формы.
Используйте микроскоп управления, чтобы найти область интереса и нарисовать наброски вокруг области интересов. Затем выберите трубку для сборщика назначения и нажмите Start Cut, чтобы продолжить микропересасывание тканей. Когда все области, представляющие интерес, будут вскрыты, перенесите коллекторные трубки из держателя на сухой лед до тех пор, пока они не будут обрабатываться ниже по течению.
Для приобретения тканей с превосходной морфологией и целостностью РНК оценивались различные перфузионное подходы. Чтобы вскрыть области интереса, необходимо окрашивать ткани безобидными красителями для РНК. Последующая перфузия опухолевых мышей с раствором тирода и 30%сахарозой, за которой следует ночная инкубация в 30% сахарозы, приводит к сохранению морфологии и целостности РНК ткани мыши.
Хотя фиксация параформальдегидной ткани приводит к высокое качество морфологии тканей, целостность РНК негативно влияет. Другие подходы, такие как использование инкубации раствора тирода, или раствор тирода плюс 30% инкубации раствора сахарозы, не влияют на качество РНК, но наблюдается снижение разрешения в морфологии тканей. Если ткани не монтируются с монтажной средой, секции обезвоживаются и морфология ухудшается при монтаже образцов тканей с 15%mounting среды растворяется в воде поддерживает высокое качество морфологии тканей.
Лазерная визуализация микроскопа захвата позволяет получить выбор опухолевой ткани для вскрытия. Эта область выбора интереса затем позволяет вскрытие областей, представляющих интерес в каждом образце ткани для анализа целостности РНК. Поддержание высокого качества морфологии опухолевых тканей и целостности РНК имеет решающее значение.
Тиродный раствор и 30% перфузия сахарозы с сохранением на ночь в 30%сахарозе значительно улучшают морфологию тканей для LMD. Быстрая фиксация лиомы, окрашивание и монтаж раствором GAN является критическим шагом к сохранению качества РНК и предотвращению образования трещин в тканях. Мы рекомендуем секции по крайней мере 2,5 раза от 10 до 6 квадратных микрометров общей опухоли на область ткани, чтобы получить соответствующее количество РНК для контроля качества РНК и транскриптомного анализа.
LMD позволяет проводить анализ молекулярных сигнальных путей, которые регулируют глиомную гетерогенность и вторжение, которые могут выявить новые потенциальные цели для будущего трансляционного развития в доклиникальных моделях глиомы.
