Ce protocole utilise la microdissection laser et le séquençage de l’ARN pour analyser l’expression différentielle de l’ARNm de l’hétérogénéité intratumorale, comme les zones d’accumulation de cellules mésenchymales ou les zones d’invasion tumorale. Cette méthode a été optimisée pour préserver l’histologie des tissus de bonne qualité et l’intégrité de l’ARN afin de faciliter l’acquisition d’échantillons de microdissection laser de haute qualité. Cette méthode est sensible et hautement reproductible.
Il peut être utilisé pour étudier la morphologie tumorale et l’hétérogénéité dans divers modèles tumoraux. La microdissection au laser du tissu gelé de tumeur de cerveau est une technique rentable et fiable pour l’isolement des secteurs anatomiques discrets des populations cellulaires des tissus de tumeur pour étudier leurs profils moléculaires. LMD peut être utilisé pour acquérir des connaissances mécanistes approfondies sur les événements moléculaires qui ont lieu au cours de la progression tumorale, et pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques.
Une bioluminescence in vivo de la charge tumorale de la souris atteint un signal entre une fois 10 à six et une fois 10 au 7ème photons. Rincer la solution oxygénée de tyrode par le système circulatoire de la souris tumeur-roulement euthanasiée jusqu’à ce que le foie et les poumons aient été complètement dégagés du sang. Continuer à perfuser l’animal avec une solution de saccharose à 30 % dissoute dans la solution tyrode pendant 15 minutes supplémentaires.
Pour évaluer le succès de la perfusion, confirmez que le cou, la queue et les jambes sont rigides à la fin de la circulation. Puis récoltez le cerveau selon les protocoles standard et stockez le cerveau pendant la nuit dans la solution fraîche de saccharose de 30%. Pour préparer la cryopréservation, remplissez un bocal d’isopentane-2-méthylbutane froid et placez le bocal dans un récipient rempli d’azote liquide.
Pendant que le solvant refroidit, épongez le cerveau à sec sur un morceau de papier filtre et placez le cerveau dans un Cryomold étiqueté. Soigneusement à environ cinq millilitres de température optimale de coupe moyenne au centre du Cryomold et placer le cerveau dans le moule dans l’orientation désirée. À l’aide de forceps propres, placez rapidement le Cryomold dans l’isopentane-2-méthylbutane réfrigéré pendant 30 à 40 secondes.
Une fois que le milieu de coupe s’est solidifié, transférez le Cryomold sur de la glace sèche et enveloppez le Cryomold et enroulez le tissu cérébral congelé dans du papier d’aluminium pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Pour acquérir des sections congelées de tissu de tumeur de cerveau, réglez d’abord la température d’un cryostat entre moins 20 et moins 24 degrés Celsius, et placez le bloc d’échantillon dans la chambre de cryostat pendant 30 à 60 minutes. Pendant que l’échantillon est en équilibre, nettoyez la chambre et le porte-couteau avec 100 % d’éthanol et vaporisez les brosses de section avec la solution de nettoyage RNase.
Lorsque l’échantillon est prêt, retirez le moule et utilisez un milieu de coupe frais pour fixer le bloc de tissu congelé au disque du spécimen du cryostat. Placez le bloc dans le support du disque et alignez le bloc avec la lame du couteau. Acquérir 10 sections de micromètres du cerveau à l’aide de l’une des brosses sans arnse pour aplatir et décharger soigneusement les morceaux de tissu sur la surface de coupe.
Pour monter les sections de tissu cérébral sur les glissières, appuyez en douceur sur le côté chargé positivement d’une glissière en verre PEN sans RNase étiquetée sur la section et placez la glissière dans une boîte de rangement à l’intérieur de la chambre. Lorsque toutes les diapositives ont été recueillies, placez la boîte de stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour dissoudre le milieu de coupe avant la microsection laser, submergez les glissières en immersions séquentielles d’éthanol descendant de 30 secondes suivies d’une coloration de solution violette cristalline pendant 20 secondes et de cinq secondes dans la solution Y d’éosine de 0,5 %.
À la fin de l’incubation de l’éosine Y, utiliser du papier filtre pour bloquer les glissières sèches et déshydrater les glissières dans des immersions d’éthanol ascendantes séquentielles. Après l’immersion de 60 secondes dans l’éthanol, rincer les glissières dans un contenant de xylène pendant trois minutes. Ensuite, séchez les glissières sur une surface exempte de RNase à température ambiante pendant 10 secondes avant de monter les échantillons dans un milieu de montage préparé avec de l’eau sans RNase.
Après 10 à 20 secondes, transférez les diapositives sur la plate-forme de microdissection du microscope. Pour la microdissection de capture laser, allumez la puissance avant d’allumer le laser. Ensuite, allumez le contrôleur de microscope dans l’ordinateur et démarrez le logiciel de microdissection de capture laser.
Dans le panneau microscope control, sélectionnez le grossissement 10 fois. Sous contrôle laser, définissez les paramètres laser pour la dissection des tissus et sélectionnez une fréquence laser de 120 hertz et un courant laser de 100% pour une microdissection laser précise, réglez la vitesse à 10 et réglez l’ouverture à 10 micromètres. Réglez ensuite la puissance à 53.
Chargez le collecteur de tissus qui capturera le tissu suivant la section et cliquez sur le deuxième bouton Déchargement. Remplacez le collecteur vide par des tubes à tête plate PCR sans DNase et Rnase contenant 30 microlitres de tampon de lyse par tube. Retournez le collecteur à la machine et cliquez continuer à procéder.
Chargez le spécimen traité sur le microscope et cliquez sur Déchargez dans le logiciel de microdissection laser. Montez l’échantillon sur le support de la glissière et placez le porte-diapositives sur la scène. Cliquez continuer à procéder et sélectionnez Dessiner Cut dans la fenêtre Formes coupées.
Utilisez les commandes au microscope pour trouver le domaine d’intérêt et dessiner un aperçu autour de la région d’intérêt. Sélectionnez ensuite un tube collecteur de destination et cliquez sur Démarrer la coupe pour procéder à la microdissection tissulaire. Lorsque tous les domaines d’intérêt ont été disséqués, transférez les tubes collecteurs du support sur de la glace sèche jusqu’à ce qu’ils soient traités en aval.
Pour acquérir des tissus avec une morphologie supérieure et l’intégrité de l’ARN, diverses approches de perfusion ont été évaluées. Pour disséquer les zones d’intérêt, il est nécessaire de tacher les tissus avec des colorants inoffensifs pour l’ARN. La perfusion suivante des souris tumorales avec la solution de tyrode et le saccharose de 30%suivi d’une incubation de nuit dans 30% de saccharose a comme résultat la conservation de la morphologie et de l’intégrité d’ARN du tissu de souris.
Bien que la fixation des tissus paraformaldéhyde entraîne une morphologie tissulaire de haute qualité, l’intégrité de l’ARN est affectée négativement. D’autres approches telles que l’utilisation d’une solution tyrode incubation, ou la solution tyrode plus 30% incubations de solution saccharose n’affectent pas la qualité de l’ARN, mais une résolution réduite dans la morphologie tissulaire est observée. Si les tissus ne sont pas montés avec le milieu de montage, les sections deviennent déshydratées et la morphologie se détériore tandis que le montage des échantillons de tissu avec le milieu de montage de 15% dissous dans l’eau maintient une morphologie tissulaire de haute qualité.
L’imagerie au microscope de microdissection de capture au laser permet la sélection du tissu tumoral pour la dissection. Cette sélection de la région d’intérêt permet ensuite la dissection des zones d’intérêt dans chaque échantillon de tissu pour l’analyse de l’intégrité de l’ARN. Le maintien d’une morphologie de tissu tumoral de haute qualité et de l’intégrité de l’ARN est essentiel.
La solution tyrode et la perfusion de saccharose de 30% avec la conservation du jour au lendemain dans 30% saccharose améliore considérablement la morphologie de tissu pour LMD. La fixation rapide de lyoma, la coloration et le montage avec la solution de GAN est étape critique pour préserver la qualité d’ARN et empêcher des fissures de se former dans le tissu. Nous recommandons de sectionner au moins 2,5 fois 10 à la tumeur totale de micromètres carrés par zone de tissu pour obtenir des quantités appropriées d’ARN pour le contrôle de qualité d’ARN et l’analyse transcriptomique.
LMD permet l’analyse des voies de signalisation moléculaires qui régulent l’hétérogénéité et l’invasion du gliome qui pourraient révéler de nouvelles cibles potentielles pour le développement translationnel futur dans les modèles précliniques de gliome.
