Мы улучшили ранее опубликованный метод RiboTag, чтобы значительно уменьшить фон. Это упрощает применение сложных моделей, таких как система мутантов, с точки зрения анализа и гораздо менее дорогостоящим. Помимо экспериментального поколения животных, метод RiboTag значительно проще и проще, чем другие методы для анализа рибосомы связанных mRNAs.
Как и все эксперименты РНК, строгие условия RNase свободных имеют основополагающее значение для успеха. Если у вас ограниченный опыт работы с РНК, проверьте свои условия, сначала выполняя основные извлечения РНК затем двигаться дальше. Демонстрацией процедуры будет Лорен Чукралла, аспирантка из моей лаборатории.
Для подготовки буфера гомогенизации добавьте 2,5 миллилитров одного молярного три при рН 7,4, пять миллилитров одного хлорида толярного калия, 600 микролитров одного хлорида молира магния и 500 микролитров MP40 до 50 миллилитров трубки. Добавить дитил пирокарбонат-обработанной воды в трубку, чтобы довести объем до 50 миллилитров и перемешать, пока все компоненты включены. Для подготовки буфера для мытья с высоким содержанием соли добавьте 2,5 миллилитров одного моларного три при рН 7,4, 15 миллилитров одного моларного хлорида калия, 600 микролитров одного хлорида молира магния и 500 микролитров MP40 до 50 миллилитров трубки.
Довнесите его до объема 50 миллилитров в дитил пирокарбонатной воде и перемешайте до тех пор, пока все компоненты не будут включены. Предварительно взвесить все пробные трубки, зафиксировать вес и предварительно охладить в жидком азоте. Предварительно прохладный стерильный раствор, пестик и взвешивание шпателя на сухом льду.
Затем на сухом льду используйте предварительно охлажденный стерильный раствор и пестик, чтобы разбить флэш-образцы замороженных тканей на большие кусочки и медленно измельчить его в мелкий порошок. Используя предварительно охлажденный шпатель, соскребать порошок из раствора в предварительно охлажденой трубки сбора заботясь, чтобы держать на сухом льду, когда это возможно. Взвесь трубку с порошком ткани.
Рассчитайте массу ткани, вычитая начальный вес трубки из веса трубки с образцом в ней. Заметь это значение для более поздних расчетов объемов буфера лиза. Подготовь буфер лиза, добавив в 10 миллилитров буфера гомогенизации дитиотрейтол, ингибитор RNase, циклохексимид, гепарин и одну таблетку ингибитора протеазы.
Смешайте до тех пор, пока все компоненты включены и держать на льду до использования. На каждые 100 миллиграммов образца добавьте один миллилитр буфера лиза. С той же пипетки используется для добавления буфера лиза, тщательно пипетки в результате лизать вверх и вниз, чтобы фрагментировать клетки и перемешать.
Продолжайте пипетки, как правило, от 25 до 30 ударов, пока образец больше не вязкий. Установите образцы на льду в течение 10 минут, чтобы подставить. Затем вращаем образцы в предварительно охлажденой центрифуге при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут при 10 000 г.
В нижней части трубки образуется большая рыхлая мутная гранула. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы, собирать лисат в новую трубку и записывать объем для каждого образца. Чтобы предотвратить деградацию образцов, убедитесь, что образцы остаются прохладными на протяжении всего оставшегося протокола хранения на льду или при четырех градусах Цельсия, когда это возможно.
Теперь вычислите необходимый объем магнитных бусин в сочетании с соответствующим связывающим антителом белком, белком G.Для одного миллилитра лизата используйте 375 микролитров белковых шариков G, чтобы достичь 30 миллиграммов на миллилитр. Поместите шариковой раствор в 1,7 миллилитровую трубку на стойку магнитной трубки. Удалите растворитель шарика и добавьте равный объем буфера свежего лиза к бисеру.
На скамейке трубки ротатор установлен до 20 об /мин при четырех градусах по Цельсию, поверните трубку пять минут, чтобы вымыть. Поместите трубку на стойку магнитной трубки и удалите буфер стирки. После повторения мыть еще два раза, добавить буфер лиза на исходный объем, чтобы уравночные бусы.
Хранить при четырех градусах по Цельсию или на льду до использования. Добавьте 50 микролитров равномерных бусин на каждый миллилитр лизата и поверните при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем поместите трубку на магнитную стойку и соберите лисат в свежую трубку.
Откажитесь от использованных бусин. К лизате добавьте 25 микролитров равномерных бусин на каждый миллилитр и поверните при четырех градусах цельсия в течение одного часа. Храните оставшийся равновесный белок G шарики при четырех градусах по Цельсию на ночь.
Утром поместите трубку на магнитную стойку и соберите лисат в свежую трубку. Откажитесь от использованных бусин. Из очищенного лизата сохраните 50 микролитров в качестве элементов управления вводом выборки.
Хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию. На каждый миллилитр очищенного лизата добавьте пять микрограммов антител против HA. Чтобы предотвратить потерю образца, запечатать крышку трубки лабораторной пленкой и повернуть образцы от 16 до 18 часов при четырех градусах цельсия.
На каждый миллилитр очищенного лизата добавьте 300 микролитров белка G шариков. Запечатать крышку трубки лабораторной пленкой и повернуть в течение двух часов при четырех градусах по Цельсию. Поместите образец трубки на магнит стойку, чтобы бисер отделиться от IPed лисировать.
Pipette от потока через лизировать и отказаться, сохраняя бисер. Добавьте в бисер 800 микролитров буфера для мытья высокой соли. Поместите трубку на ротатор в течение 10 минут при четырех градусах цельсия.
Поместите образец трубки на магнит стойку и позволить бисеру отделиться от мытья. Удалите и отбросьте стирку. Добавьте еще 800 микролитров буфера для мытья высокой соли в бисер.
Закройте трубку и дайте ей вращаться в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Поместите образец трубки на магнит стойку и позволить бисеру отделиться от мытья. Удалите и отбросьте стирку.
Повторите мыть еще раз. После мытья добавьте в бисер 3,5 микролитров 14,2 молярного бета-меркаптоэтанола и перемешайте вихрем в течение 15 секунд. Извлекайте РНК с помощью коммерческого комплекта для очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя.
Elute образец в 30 микролитров RNase бесплатной воды. Храните образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В этом исследовании, очень мало РНК была изолирована от образцов, не имеющих либо Cre или Rpl22HA демонстрируя эффективность этого протокола для уменьшения фона ИС и изолировать подлинные HA помечены рибосомные РНК.
Ряд антител в протоколах изоляции РНК были протестированы в положительных образцах Cre и Rpl22HA. Эти результаты показывают, что выбор реагентов может оказать значительное влияние на эффективность ИС. Была изучена эффективность системы RiboTag для изоляции рибосомно-ассоциированной РНК.
Как для ввода дикого типа, так и для генотипов ИС концентрация вводимых ресурсов была значительно выше концентрации ИС, что свидетельствует о том, что в выборке ввода было больше РНК. В общем объеме пулов РНК значения числа целостности РНК, как ожидается, будут около 10 с более высоким RIN коррелирует с более высокой выведенной целостности и качества выборки. Хотя образцы ИС имели более низкий РИН, чем входные данные, РИН по-прежнему находились в приемлемом диапазоне и не зависели от генотипа выборки.
Помимо разведения и поддержания условий, свободных RNase, исследователи должны убедиться, что они собирают и держат каждый предложенный образец. Входная РНК особенно имеет ключевое значение для нескольких типов анализов ниже по течению. Для нашей лаборатории мы обычно выполняем секвенирование РНК после иммунопреципиентации.
Это позволяет нам запросить весь купол стенограммы для рибосомы ассоциации. Альтернативы будут включать анализ микроаррей или количественный RT-PCR. Для нас эта система позволяет нам выявлять изменения в рибосомно-ассоциированных РНК с мутацией специфических связывающих РНК белков.
