Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет нам изучать функцию белков, таких как внеклеточные матричные белки, которые регулируются на более поздних стадиях образования или созревания миотубера. Этот метод может быть использован, чтобы сбить любой ген, представляющий интерес в клетках C2C12 с помощью конкретных shRNAs и соответствующих аналитических инструментов для фенотипирования. Основным преимуществом этого метода является то, что мы создали клетки C2C12, которые могут непрерывно подавлять наши гены, представляющие интерес, даже в зрелых миотрубах.
Наиболее важным аспектом этой процедуры является поддержание клеток C2C12 в недифференцированном состоянии, что означает низкую плотность клеток во время обычной клеточной культуры. За день до трансфекции, семена пять раз от 10 до четвертого C2C12 клеток на миллилитр в двух миллилитров полного DMEM на хорошо в шесть хорошо пластины для достижения 40 до 50% слияния после ночного инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%CO2. На следующее утро, объединить 100 микролитров 25-миллимолярный хлорид натрия в одном 1,5-миллилитровая реакция трубки на культуру хорошо с 25,5 микролитров PEI фондовый раствор недифференцированной культуры клеток C2C12 в течение пяти минут инкубации при 37 градусов по Цельсию.
Затем объединить три микрограмма плазмидной ДНК со 100 микролитров 25-миллимолярный хлорид натрия на культуру хорошо для пятиминутной инкубации при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации смешайте весь объем каждого разбавленного реагента PEI с каждым разбавленным плазмидным раствором с нежным трубочим для 25-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия. Во время инкубации замените супернатанты клеточных культур C2C12 DMEM без антибиотиков или сыворотки.
В конце инкубации, добавить весь объем каждого трансфекции смесь к каждому хорошо в каплях, в то время как постоянно движущихся блюдо клеточной культуры. После шести часов в инкубаторе культуры клеток, заменить средний в каждом хорошо с полным DMEM. Через 24 часа после трансфекции замените полный DMEM в каждом хорошо с помощью среды отбора, дополненной пятью микрограммами на миллилитр пуромицина, и верните клетки в инкубатор клеточной культуры в течение 10-14 дней или до тех пор, пока не будут наблюдаться стабильные клетки C2C12.
Затем расширить пуромицин-устойчивых клеток C2C12 в культурах низкой плотности клеток в присутствии пяти микрограмм на миллилитр пуромицина, и криопресерв от шести до 10 флаконов клеток для будущего использования. Чтобы подготовить клетки C2C12 к дифференциации, семена 1,5 раза от 10 до пятой стабильной пуромицин-резистентных клеток C2C12 в одном миллилитре среды отбора на колодец в 12-хорошо пластины, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа, пока культуры 95% слияние. Чтобы вызвать дифференциацию, замените среду в каждом хорошо с сывороткой без DMEM каждые два дня после образования миотруба на перевернутом ярко-полевой микроскоп оснащен камерой.
Для миозин тяжелой цепи иммуностеинирования дифференцированных клеток, семена пять раз от 10 до четвертого пуромицина устойчивых C2C12 клеток в 500 микролитров полного DMEM на камеру на восемь хорошо камеры слайд, и вернуть клетки в инкубатор культуры клеток. Когда клетки достигнут 95%-ного слияния, замените средство отбора в каждой хорошо с 500 микролитров сыворотки свободной DMEM. В соответствующие экспериментальные точки времени, промыть дифференциации клеток в каждом хорошо три раза с 5 миллилитров PBS за стирку перед фиксацией клеток с 200 микролитров 4%paraformaldehyde в PBS на колодец.
После 15 минут, мыть клетки три раза со свежим PBS за стирку, как только что продемонстрировали следуют инкубации с 200 микролитров 5-молярного глицина в PBS на колодец в течение пяти минут. В конце инкубации, мыть клетки три раза, прежде чем проницать клетки с 200 микролитров 1%non-ionic сурфактант в PBS в течение 10 минут. Далее, блокировать неспецифические антитела связывания сайтов с 200 микролитеров 5%бычьего альбумин сыворотки в PBS на колодец в течение одного часа, а затем три моет в PBS.
После последней стирки, этикетки клеток с 200 микролитров миозин тяжелых цепных антител в течение двух часов при комнатной температуре. После трех промывок PBS инкубировать клетки соответствующим вторичным антителом в течение двух часов при комнатной температуре, защищенной от света. После трех окончательных моет, аспирировать PBS, и смонтировать клетки с одной каплей монтажной среды дополняется DAPI и coverslip.
Затем наблюдайте за каждой камерой на флуоресцентном микроскопе, используя соответствующий набор фильтров. Для оценки эффективности нокдауна в клеточных культурах по западной blotting, первое семя три раза 10 до пятого пуромицина устойчивых C2C12 клеток в двух миллилитров полного DMEM на колодец в шесть хорошо пластины. Через 24 часа, промыть культуры с PBS, и инициировать дифференциацию клеток с двумя миллилитров сыворотки свободной DMEM, как попродемонстрировано.
Для анализа секретных белков в соответствующих экспериментальных точках времени, собирать один миллилитр сыворотки свободной кондиционированной среды из каждого хорошо в отдельных 1,5-миллилитровых реакционной трубки для центрифугации. После центрифугации перенесите один миллилитр условных средних супернатантов в новые 1,5-миллилитровые реакционные трубки и осаждайте белки 391 микролитров трихлороацетической кислоты в неионной сурфактанте на трубку. После 30 секунд вихря, инкубировать смеси на льду в течение 10 минут.
В конце инкубации гранулы осаждаются белками путем центрифугации, и мыть белковые гранулы три раза со свежим ледяным ацетоном и одной центрифугации на стирку. После последней стирки, воздух сухой гранулы в течение трех-четырех минут при комнатной температуре до повторного получения в 50 микролитров SDS-PAGE образца буфера на трубку. Затем варить образцы в течение пяти минут при 95 градусах по Цельсию до западного анализа помарки в соответствии со стандартными протоколами.
Для внутриклеточного и мембранного анализа белка, промыть клеточный слой в каждой хорошо с двумя миллилитров PBS на колодец, и использовать сотовый скребок тщательно выбить клетки в одном миллилитровых томов PBS. Передача клеток в отдельные 1,5-миллилитровые трубки для центрифугации с последующими тремя моет в одном миллилитров PBS на трубку на стирку через центрифугации. После последней стирки, повторное использование клеточных гранул в 200 микролитров буфера лиза дополнены EDTA-бесплатный ингибитор протеазы коктейль реагент для 30-минутной инкубации на льду.
В конце инкубации ультразвуковые образцы в течение 15 секунд на льду с выходом на мощность настройки 10 на операционной частоте 23 килогерц, и удалить клеточный мусор центрифугации. Перенесите супернатанты в новые 1,5-миллилитровые реакционной трубки и определите концентрацию белка в соответствии со стандартными протоколами. Объедините 100 микрограммов белка с буфером образца 5X SDS-PAGE общим объемом 60 микролитров на образец и варите образцы в течение пяти минут при 95 градусах Цельсия.
Затем проанализируйте образцы западными пятнами на наличие желаемого целевого белка. Выбор клеток, устойчивых к пуромицину C2C12, может быть достигнут в течение 10-14 дней после трансфекции за счет эффективной ликвидации неустойчивых клеток. Как правило, более 80% клеток C2C12 отделяются от блюда клеточной культуры в течение этого периода времени и удаляются во время обычного обслуживания клеток.
Пуромицин-устойчивые C2C12 клетки, выражают контроль или ADAMTSL2 shRNA сохранить их шпиндель-образной, удлиненной морфологии клеток при низкой плотности клеток, а также их способность дифференцироваться в миотрубы. Дифференциация C2C12 при выводе сыворотки может контролироваться с помощью ярко-полевой микроскопии и иммуностимулятора для миотрубного маркера миозин тяжелой цепи. Миозин тяжелые цепные миотрубы наблюдаются в течение трех-пяти дней после начала дифференциации и многонуклеированы, как это наблюдается наличием более чем одного DAPI-позитивного ядра в границах клеток.
Как показывают данные экспрессии генов в условиях пролиферации, нокдаун эффективность трансфекции составляет от 40 до 60% Западный анализ помарки может быть выполнен, чтобы подтвердить успех нокдауна в лисатах клеток, полученных, например, из клеток C2C12, стабилизив shRNA, которые нацелены на ADAMTSL2 по сравнению с контрольными клетками, выражаюми шРНК. Будьте уверены, чтобы сохранить концентрацию пуромицина во время процесса отбора достаточно высока, чтобы устранить все неперераженочные клетки C2C12, или неперераженочные клетки могут перерастают трансфицированных клеток. Этот анализ позволяет определить функцию внеклеточных матричных белков, которые выражаются позже в развитии мышц, даже если они индуцированы через пять или десять дней после дифференциации C2C12.
Помните, что реагент экстракции РНК и бета-меркаптоэтанол должны быть обработаны в дымовой капот и обрабатывать трихлороацевую кислоту в соответствии с соответствующими протоколами безопасности. Спасибо за просмотр, и удачи в вашем эксперименте.
