Этот протокол позволяет развить нокаут мышечных клеток в любом гене, с целью дальнейшего изучения функции этого гена в мышцах. Преимущество в том, что изучать какой-либо ген дешево и быстрее, чем развитие нокаутирующих животных. Этот метод может быть использован, например, для изучения участия вновь идентифицированного гена в миопатии.
Если описанный здесь метод применяется к iPS-клеткам, это может привести к развитию нокаутирующих клеток для любого гена в любом типе клеток. Чтобы начать кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы или CRISPR-опосредованную делецию генов, сначала используйте инструменты браузера генома, такие как ensembl. org для идентификации гена-мишени вместе с последовательностями ДНК по обе стороны от него.
Чтобы получить список генных экзонов, сначала нажмите на расшифровку кодирующей белка последовательности, а затем на экзоны. Затем нажмите «Загрузить последовательность» и выберите только геномную последовательность, чтобы загрузить полную консенсусную последовательность всего гена. Прокрутите список экзонов и интронов гена, чтобы выбрать целевые.
Для проектирования направляющей РНК сначала выберите нуклеотидные последовательности интронов непосредственно вверх и вниз по течению от целевой последовательности. Затем перейдите на веб-сайт, такой как crispr.tefor. net и использовать выбранные последовательности для проектирования двух направляющих РНК, каждая длиной 20 нуклеотидов без протоспейсерного смежного мотива, разделенного несколькими сотнями пар оснований.
Далее определяют обратную последовательность комплемента для каждой направляющей РНК и упорядочивают праймеры. Чтобы построить направляющие РНК-кассеты для клонирования плазмид, сначала запустите ПЦР с одним набором праймеров, используя рецепт и программу, описанные в тексте, затем отделите продукты ПЦР в 1%-агарозный гель с использованием буфера Tris-borate-EDTA. Далее вырежьте фрагмент пары из 300 оснований и очистите с помощью комплекта.
Аналогичным образом, после проведения еще одной ПЦР с другим набором праймеров очистите 400-базовую пару длинного фрагмента ДНК в 20 микролитров буфера элюирования. Чтобы вставить направляющие РНК-кассеты в лентивирусную плазмидную основу, сначала настраивают реакцию двойного переваривания плазмиды с ферментами рестрикции Xma 1 и Blp 1, как описано в тексте. После инкубации реакционной трубки при 37 градусах Цельсия в течение одного часа, инкубируйте ее при 65 градусах Цельсия в течение 20 минут, затем запустите продукт пищеварения в 1%-агарозном геле и очистите плазмиду около 10 пар килобазов с помощью соответствующего набора.
Также количественно оцените очищенный продукт, измерив оптическую плотность. Чтобы связать кассету направляющей РНК с плазмидой, подготовьте реакционную смесь с очищенной направляющей РНК, линеаризованной плазмидной ДНК, ферментом и водой до конечного объема 10 микролитров, затем инкубируйте реакционную трубку при 50 градусах Цельсия в течение 15 минут для получения конечной плазмиды, называемой pGuide. Для производства лентивируса сначала посеяли 145-сантиметровую пластину с 1 миллионом HEK 293 клеток в DMEM с высоким содержанием глюкозы и пирувата, дополненной 10% FBS и 1% пенициллином или стрептомицином.
Затем выращивайте клетки при 37 градусах Цельсия в течение трех дней в инкубаторе 5% углекислого газа. На четвертый день проверьте клетки, чтобы обеспечить слияние от 60 до 65%. Затем готовят трансфекционный раствор, состоящий из интересующей плазмиды, плазмиды, кодирующей оболочку вируса, лентивирусной упаковочной плазмиды psPAX2 и фосфата кальция.
Отрегулируйте конечный объем до 1000 микролитров с водой. Затем добавляют трансфекционный раствор по каплям до одного миллилитра 2X HBS при перемешивании и инкубируют при комнатной температуре в течение не менее 10 минут. После этого добавьте раствор по каплям в ячейки.
Для однородного распределения трансфекционного раствора осторожно наклоните пластину во всех направлениях, затем инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в 5% инкубаторе углекислого газа в течение не менее пяти часов. Далее снимите носитель с пластин и промыте клетки PBS, чтобы избавиться от трансфекционных реагентов, затем добавьте 12 миллилитров свежей среды. После 48 часов инкубации при температуре 37 градусов цельсия выложите среду со всех пластин в трубку.
Поместите трубку в герметичное ведро и центрифугу при 800 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, затем отфильтруйте супернатант с помощью 0,45-микрометрового фильтра и центрифугируйте фильтрат при 68, 300 раз G в течение двух часов при четырех градусах Цельсия, используя качающийся ротор ковша. После удаления супернатанта держите трубки вверх ногами на бумажном полотенце в безопасном шкафу в течение пяти-10 минут для максимального удаления жидкости из гранул. Добавьте 100 микролитров пролиферационной среды HEC и держите трубки при четырех градусах Цельсия в течение не менее двух часов.
Затем повторно суспендировать гранулу путем пипетки. После сбора всех повторно суспендированных гранул сделайте аликвоты по 10 или 25 микролитров, затем храните аликвоты при минус 80 градусах Цельсия после мгновенного замораживания в жидком водороде. Для трансдукции миобластов сначала засейте каждую лунку 96-луночной пластиной со 100 микролитрами пролиферационной среды, содержащей 10 000 клеток миобласта.
На следующий день добавьте предварительно рассчитанные объемы направляющих LV и LV Cas9 в ячейки в шкафу безопасности. После пяти дней инкубации выпустите клетки из колодца, добавив трипсин. После подсчета номеров ячеек перенесите ячейки из колодцев со слиянием от 40 до 50% на новую пластину.
После пяти часов инкубации добавьте расчетные объемы убийцы ЛЖ при множественности инфекции 20 и инкубируйте в течение пяти-10 дней или, по крайней мере, двух проходов между ними. Для функциональной характеристики генетически отредактированных клонов с помощью кальциевой визуализации, пластина 50 000 клеток в центре 35-миллиметровой тарелки с ламининовым покрытием. Чтобы вызвать дифференциацию, добавьте среду дифференциации, как описано в тексте.
После шести дней инкубации снимите культуральную среду и очертите клетки гидрофобной ручкой. Затем добавляют 50 микролитров Fluo-4 Direct, разбавленного один к одному в дифференцирующей среде, к дифференцированным миотрубкам. После инкубации посуды при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут дважды промывайте клетки буфером Кребса, дополненным одним миллиграммом на миллилитр глюкозы.
Затем используйте инвертированный флуоресцентный микроскоп или конфокальный микроскоп с объективом 10X для измерения вариаций флуоресценции со скоростью один кадр в секунду в течение 90 секунд и выберите поле с не менее чем 10 миотрубками. После удаления дополнительного буфера Кребса стимулируйте клетки двумя миллилитрами хлорида калия для деполяризации мембраны или двумя миллилитрами флорохлорала метакресола или прямой стимуляции 4CmC или RyR1. Визуализируйте вариацию флуоресценции после стимуляции, а затем количественно оцените вариацию флуоресценции в каждой миотрубе.
Этот протокол может быть успешно использован для выбивания гена RyR1 из миобластов человека, что привело к более короткой геномной ДНК в клетках. Нокаут RyR1 также был подтвержден на уровне белка, поскольку белок RyR1 не мог быть обнаружен в клетках-мишенях с помощью вестерн-блоттинга. Отсутствие активности RyR1 в миотрубах, дифференцированных от нокаут-клеток RyR1, было дополнительно подтверждено визуализацией кальция Fluo-4 после прямой стимуляции RyR1 4CmC или косвенной стимуляции деполяризацией мембраны, вызванной хлоридом калия.
Последовательность, которая будет удалена, должна быть необходима для прогнозирования функционального белка. Этот метод идеально подходит для разработки постгеномных инструментов для изучения участия нового гена в мышечных заболеваниях.
