Там было много усилий, чтобы вызвать эриптоз с помощью иономицина. Однако точная процедура этого процесса четко не изложена в литературе. Мы предоставляем пошаговую процедуру, чтобы вызвать эриптоз с помощью иономицина.
Основным преимуществом этой процедуры является индуцировать эриптоз в эритроцитах человека надежным и воспроизводимым образом. Для начала добавьте 500 микролитров холодной цельной крови в кислотный цитрат декстроза в микроцентрифугную трубку. Центрифуга всей крови в 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре и удалить щепу плазмы и тонкой баффи пальто с помощью пипетки, чтобы оставить красный слой эритроцитов.
Приготовьте один литр раствора Ringer, содержащего 125 миллимолярия хлорида натрия, пять миллимолярия хлорида калия, один миллимолянный сульфат магния, 32 миллимолярных HEPES, пять миллимоляр глюкозы и один миллимолянный хлорид кальция. Отрегулируйте рН до 7,4, добавив две капли микролитера одного гидроксида натрия моляра. Для приготовления раствора Ringer без глюкозы следуйте тому же протоколу, но не включайтесь в раствор глюкозы.
Вымойте эритроциты дважды в растворе Ringer, приостановив гранулы клетки в 1,5 миллилитров раствора Ringer, центрифугирование в 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре и удаление супернатанта. Затем сделайте 0,4%гематокрит путем повторного перерасхода 40 микролитров эритроцитов гранулы в 9, 960 микролитров без глюкозы Ringer раствор для достижения окончательного объема 10 миллилитров. Инкубировать подвеску клетки при 37 градусах по Цельсию в течение семи дней.
Предварительная инкубация эритроцитов в буфере без глюкозы значительно вызывает эриптоз. Высокий эриптоз был получен после семи дней предварительной инкубации в буфере без сахара. Растворите один миллиграмм соли кальция иономицина в 630 микролитров DMSO, чтобы достичь конечной концентрации двух миллимоляров.
Aliquot в 20 миллилитров и хранить при минус 20 градусов по Цельсию. Возьмите один миллилитр подготовленного 0,4% гематокрита и добавьте 0,5 микролитров двух миллимолярный иономицин, чтобы достичь конечной концентрации одного микромолара. Инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию.
Используйте один миллилитр гематокрита без лечения иономицина в качестве отрицательного контроля. Центрифуга иономицин лечение и необработанные гематокриты в 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре и удалить их supernatants оставить клетки гранулы в нижней части труб. Вымойте клетки три раза раствором Ringer, приостановив клеточные гранулы в 1,5 миллилитров раствора Ringer, центрифугирование при 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре и отбрасывая супернатанты.
Для измерения гемолита добавьте один миллилитр необработанного 0,4%гематократа в микроцентрифугную трубку и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию в качестве отрицательного контроля 0%гемолита. Чтобы подготовить положительный контроль 100%гемолита, добавьте один миллилитр необработанного 0,4%гематократа в микроцентрифугную трубку и центрифугу при 700 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и добавьте один миллилитр дистиллированной воды в клеточные гранулы, чтобы повторно использовать и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию.
Затем добавьте один миллилитр иономицина, обработанного 0,4% гематократа, в микроцентрифугную трубку. Центрифуга необработанных клеток, обработанных клеток и клеток в дистиллированной воде в 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Перенесите 200 микролитров супернатантов в каждый колодец из пластины из 96 колодец.
Измерьте абсорбанс на 541 нанометров с помощью микро-считыватель пластин. Рассчитайте гемолиз с помощью уравнения, где A0, A100 и AT являются абсорбцией эритроцитов в растворе Ringer в воде и поглощением обработанных эртироцитов иономицином. Разбавить два миллилитров 5X Annexin-V связывающего буфера в восьми миллилитров PBS для получения 1X связывания буфера.
Повторное производство обработанных иономицином и необработанных клеточных гранул в одном миллилитре 1X связывающего буфера. Возьмите 235 микролитров клеточных суспензий в буфере связывания и добавьте 15 микролитров конъюгации Annexin-V Alexa Fluor 488 в микроцентрифуговую трубку. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 20 минут в темном месте.
Центрифуга при 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант. Вымойте клетки дважды с 1X связывающим буфером, приостановив гранулы клетки в 1,5 миллилитров связывающего буфера и центрифугирование при 700 раз g в течение пяти минут при комнатной температуре.
Удалите супернатант и повторно посовестите клеточные гранулы в 250 микролитров 1X связывающего буфера для измерения цитометрии потока. Теперь перенесите 200 микролитров окрашенных эритроцитов Annexin-V в один миллилитр круглых нижних полистироловых трубок, совместимых с цитометрией потока. Войдите в программное обеспечение цитометрии потока и нажмите на новую кнопку эксперимента.
Нажмите на новую кнопку трубки. Выберите глобальный лист и выберите анализ применения для измерения интенсивности флуоресценции с возбуждением длины волны 488 нанометров и длиной волны выбросов 530 нанометров. Установите количество ячеек до 20 000, которые будут собраны для анализа флуоресценции активированной сортировки клеток.
Выберите нужную трубку и нажмите на кнопку нагрузки. Нажмите на кнопку записи для измерения рассеяния вперед и бокового рассеяния. Повторите для всех образцов.
Нажмите кнопку «Справа» на кнопку «Образец» и нажмите на анализ партии для создания файла результатов. Нажмите кнопку «Справа» и нажмите на файлы FSC. В этом протоколе, лечение эритроцитов с одним микромолярным иономицином и Ringer решение в течение двух часов было достаточно, чтобы вызвать эриптоз, о чем свидетельствует успешная маркировка с Annexin-V Fluor 488 спряжения и количественной оценки по анализу FACS.
Более высокие концентрации иономицина в 5 и 10 микромолях привели к небольшому увеличению эриптоза. Однако такие концентрации также усиливают гемолиз. Инкубации эритроцитов в растворе иономицин и рингер всего за 30 минут было достаточно, чтобы вызвать эриптоз.
Увеличение инкубации увеличило уровень эриптоза на срок до двух часов. Однако дальнейшее инкубацио время привело к незначительному снижению уровня эриптоза. Более высокое значение гемолизиса через 180 минут объясняет снижение эриптоза после того же количества инкубации, что и менее жизнеспособные клетки, существовавшие на 180 минут лечения иономицином.
Эритроциты с иономицином показали яркий сигнал флуоресценции к связыванию Приложения-V с фосфатил серином во внешней листовке. В отличие от этого, клетки без лечения показали очень слабый сигнал флуоресценции, указывающий на очень низкий эриптоз. Предварительная инкубация в буфере без глюкозы является важным триггером для индукции эриптоза.
Так как эриптоз наблюдается при широком спектре заболеваний, эксперименты, следующие по этому протоколу, специфичны для поля. В нашей лаборатории мы заинтересованы в изучении влияния эриптоза на мембранные биофизические свойства и мембранные взаимодействия с наноматериалами. Эриптоз связан с большим количеством заболеваний, включая диабет, серповидноклеточная анемия и талассемия.
Наличие воспроизводимого протокола для индуцирования эриптоза может помочь исследователям в любой из этих областей исследовать дальнейшие научные вопросы, характерные для каждой области.
