Этот метод позволяет клеточной структуры и функции, которые будут возмущены путем слияния двух различных типов клеток для решения таких вопросов, как, как клетки реагируют на изменения в номере органеллы. С помощью изображений флуоресцентно помеченных белков в сплавленных клетках, клеточные структуры могут быть ссылаются обратно на их клеточный тип происхождения для изучения механизмов органеллы гомеостаза и функции. Для флуоресцентных красителей маркировки, увидеть человеческие раковые клетки населения, представляющие интерес таким образом, что каждая культура будет расширена, по крайней мере шесть раз от 10 до шестой клетки на 70 до 90% слияния на следующее утро.
В день маркировки, мыть rootletin eGFP и rootletin-mScarlet клетки два раза с 10 миллилитров PBS за стирку. Разбавить фиолетовый клеточный краситель до 500 наномолярных в PBS и Far Red cell красителя до 200 наномолярных в PBS. Этикетка корневых клеток eGFP с разбавленным фиолетовым клеточным красителем и клетками rootletin-mScarlet с разбавленным красителем дальних красных клеток в течение одной минуты при комнатной температуре.
В конце инкубации, остановить реакции с 10 миллилитров DMEM в течение пяти минут. Вымойте обе помеченные клеточные культуры и одну неописаенную культуру родительских клеток с 10 миллилитров свежего PBS, прежде чем инкубировать все культуры одним миллилитром довоенного трипсина. В конце инкубации перенесите отдельные клеточные растворы на отдельные 15 миллилитровых конических трубок для центрифугации и аккуратно перезаполните краситель помеченными гранулами в одном миллилитре PBS и необъявленных клетках в одном миллилитре DMEM.
Затем верните все образцы клеток в инкубатор клеточной культуры. Для эксперимента по синтезу клеток смешайте 500 микролитров фиолетового красителя с 500 микролитров красителя Far Red с маркировкой клеток в новой 15-миллилитровой трубке и от осадки оставшихся несмешанных помеченных клеток центрифугой. Переусейте гранулы в один миллилитр свежего DMEM и поместите клетки обратно в инкубатор.
Соберите смешанные клетки путем центрифугации и добавьте 700 микролитров 50%1450 PEG в капле мудрым образом к грануле в течение 30 секунд. После 3,5 минут при комнатной температуре добавьте 10 миллилитров без сыворотки DMEM в течение 30 секунд и поместите трубки в инкубатор на 10 минут. В конце инкубации отложения смешанных клеток центрифугации и аккуратно повторно гранулы в один миллилитр полной среды.
Чтобы обогатить популяцию сплавленных клеток с помощью FACS, аккуратно отфильтруйте все клетки в отдельные трубки FACS через 70 микрометровый ситечко и создайте вперед рассеяние по сравнению с боковым рассеянием и дублетом участков дискриминации в программном обеспечении цитометра. Запустите неоцеличные клетки, чтобы зафиксировать их интенсивность флуоресценции и создать ворота для идентификации сплавленных клеток. Далее, запустить один положительный фиолетовый краситель помечены клетки, чтобы подтвердить, что нет никакого распространения фиолетового сигнала в канал Far Red и одного положительного Far Red красителя помечены клетки, чтобы подтвердить, что нет сигнала Far Red в фиолетовом канале.
Затем кратко запустите образец синтеза, чтобы подтвердить, что сплавленные клетки видны с этими воротами. Когда параметры сортировки были установлены, выровнять поток сортировки централизованно в восемь хорошо изображения блюдо, содержащее 100 микролитров среднего роста и сортировать двойной положительный сплавленных клеток непосредственно в блюдо. Когда все клетки были отсортированы, немедленно поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры в течение двух-16 часов.
Для иммунофлуоресцентного окрашивания сначала замените супернатант клеточной культуры 200 микролитров 4%параформальдегида для 15-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце фиксации, мыть клетки три раза с 200 микролитров PBS на стирку до проницаемости клеток в 200 микролитров 0,1% неионического сурфактанта в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее, блокировать неспецифические связывания с 200 микролитеров 3%бычьего альбумин сыворотки в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре следуют маркировки с антителами интереса в 150 микролитров окрашивания буфера.
После одного часа при комнатной температуре, мыть клетки два раза в 300 микролитров PBS в течение пяти минут за стирку. После последней стирки замените стирку 200 микролитров свежего PBS. Для получения изображений слитых клеток используйте соответствующий флуоресцентный микроскоп, способный четырехцветную визуализацию и собирать трехмерные изображения.
Соответствующие помеченные клетки видны во время цитометрии потока флуоресцентным сигналом на более высоком уровне, чем неоцеличные контрольные клетки. Ворота могут быть установлены для сортировки, чтобы обогатить для двойной положительной популяции клеток непосредственно в визуализации посуды для дальнейшего микроскопического анализа. Слияние вызывает серьезную перестройку клеточной архитектуры путем смешивания двух ячеек в одну.
Гетерокарионы идентифицируются как клетки, содержащие оба флуоресцентных сигнала красителя, смешанные внутри одной клетки без вмешательства плазменных мембран. Кроме того, два ядра могут быть также видны в сплавленных клетках с помощью изображения Брайтфилда. Структура и функция клеток могут быть дополнительно исследованы путем слияния клеток, содержащих meGFP и mScarlet помечены белками.
Слияние приводит к удвоению центросомного числа внутри гетерокарионов, видимых как по крайней мере четыре перикентриолярных материальных очагов, когда центросомный перисентриолярный компонент NEDD1 флуоресцентно помечен. Слияние клеток с эндогенно флуоресцентно помеченным корнелетином позволяет идентифицировать клетку происхождения каждой центросомы в гетерокарионе. Этот протокол демонстрирует, как сплавить дифференциально помеченные клеточные линии и как изумить их органеллы, чтобы понять их структуру и функцию.
Этот надежный протокол относительно прост и относительно недорог в работе по сравнению с аналогичными методами. Этот метод может быть использован для задать целый ряд вопросов, таких как, как регулируется синтез органелл и как клетки реагируют на изменения в субклеточном номере органеллы.
