هذه الطريقة تسمح بنية الخلوية وظيفة أن تكون مضطربة من خلال دمج نوعين مختلفين من الخلايا لمعالجة أسئلة مثل كيف يمكن الخلايا الاستجابة للتغيرات في عدد organelle. عن طريق تصوير البروتينات الموسومة الفلورية داخل الخلايا المنصهرة، يمكن الرجوع إلى الهياكل الخلوية مرة أخرى إلى نوع الخلية المنشأ لدراسة آليات التوازن العضلية والوظيفة. لوضع علامات صبغ الفلورسنت، انظر مجموعات الخلايا السرطانية البشرية ذات الأهمية بحيث أن كل ثقافة سوف تتوسع إلى ما لا يقل عن ست مرات 10 إلى الخلايا السادسة في التقاء 70 إلى 90٪ بحلول صباح اليوم التالي.
في يوم وضع العلامات، وغسل الجذر eGFP وخلايا rootletin-mScarlet مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. تمييع صبغ الخلية البنفسجية إلى 500 نانوموللار في برنامج تلفزيوني وصبغ الخلية الحمراء البعيدة إلى 200 نانومولار في برنامج تلفزيوني. تسمية خلايا الجذر eGFP مع صبغة الخلية البنفسجي المخففة وخلايا rootletin-mScarlet مع صبغة الخلية الحمراء البعيدة المخفف لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانات، ووقف ردود الفعل مع 10 ملليلتر من DMEM لمدة خمس دقائق. غسل كل من الثقافات الخلية المسمى وثقافة واحدة الخلية الأبوية unlabeled مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد قبل احتضان جميع الثقافات مع ملليلتر واحد من التربسين مسبق الدفء. في نهاية الحضانة، نقل حلول الخلية المنفصلة إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر فردية للطرد المركزي وإعادة تعليق بلطف الكريات الصبغية المسماة في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني والخلايا غير المسماة في ملليلتر واحد من DMEM.
ثم قم بإرجاع كافة عينات الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. لتجربة دمج الخلايا، اخلط 500 ميكرولترات من الخلايا ذات الصبغة البنفسجية المسماة مع 500 ميكرولترات من الخلايا المسماة صبغ أحمر أقصى في أنبوب جديد 15 ملليلتر والرواسب الخلايا غير المخلطة المتبقية التي تسمى بالطرد المركزي. resuspend الكريات في ملليلتر واحد من DMEM الطازجة ووضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة.
جمع الخلايا المختلطة عن طريق الطرد المركزي وإضافة 700 ميكرولترات من 50٪ 1450 PEG بطريقة قطرة من الحكمة إلى بيليه على مدى فترة 30 ثانية. بعد 3.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، إضافة 10 ملليلتر من الدم خالية DMEM قطرة الحكمة على مدى فترة 30 ثانية ووضع الأنابيب في الحاضنة لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، الرواسب الخلايا المختلطة عن طريق الطرد المركزي وبلطف resuspend بيليه في ملليلتر واحد من المتوسط الكامل.
لإثراء للسكان خلية تنصهر من قبل FACS، وتصفية بلطف جميع الخلايا في أنابيب FACS الفردية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر وخلق مبعثر إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر ومؤامرات التمييز المزدوج في برنامج مقياس الخلايا. تشغيل الخلايا غير المُ وسم لتسجيل كثافة الفلوريسنس وإنشاء بوابات لتحديد الخلايا المُندمجة. بعد ذلك، تشغيل إيجابية واحدة البنفسجي صبغ الخلايا المسمى للتأكد من أنه لا يوجد امتداد للإشارة البنفسجية في قناة أحمر الأقصى واحد الإيجابية أحمر أقصى الخلايا المسماة للتأكد من أنه لا توجد إشارة حمراء الأقصى في قناة البنفسجي.
ثم تشغيل لفترة وجيزة عينة الانصهار للتأكد من أن الخلايا التي تنصهر مرئية مع هذه البوابات. عندما تم تعيين معلمات الفرز، محاذاة تيار الفرز مركزيا في طبق التصوير ثمانية بئر تحتوي على 100 ميكرولترات من متوسط النمو وفرز الخلايا التي تنصهر إيجابية مزدوجة مباشرة في الطبق. عندما تم فرز جميع الخلايا، ضع الطبق على الفور في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعتين إلى 16 ساعة.
للتلوين المناعي، أولا استبدال الخلية ثقافة مغالى مع 200 ميكرولترات من 4٪ شبهفورمالدهيد لاحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية التثبيت، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل غسل قبل permeabilizing الخلايا في 200 microliters من 0.1٪ السطحي nonionic لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. المقبل، كتلة الربط غير محدد مع 200 ميكرولترers من 3٪ البوم مصل البقر في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها وضع العلامات مع الأجسام المضادة ذات الاهتمام في 150 ميكرولترات من عازلة تلطيخ.
بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا مرتين في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، استبدل الغسيل بـ 200 ميكرولترات من برنامج PBS الطازج. للحصول على صور للخلايا المُندمجة، استخدم مجهرًا مضنيًا مناسبًا قادرًا على التصوير بأربعة ألوان وجمع صور ثلاثية الأبعاد.
الخلايا المسماة بشكل مناسب مرئية أثناء عملية استئصال الخلايا المتدفقة بواسطة إشارة الفلورسنت عند مستوى أعلى من خلايا التحكم غير المسماة. يمكن تعيين البوابات لفرز لإثراء للسكان الخلايا الإيجابية المزدوجة مباشرة في أطباق التصوير لمزيد من التحليل المجهري. الانصهار يدفع إعادة ترتيب كبيرة للهندسة الخلوية من خلال خلط خليتين في واحدة.
يتم تحديد هيتروكاريونس كخلايا تحتوي على كل من إشارات صبغ الفلورسنت مختلطة داخل خلية واحدة دون الأغشية البلازما التدخل. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون نويتي أيضا مرئية في الخلايا المنصهرة عن طريق التصوير برايتفيلد. ويمكن مواصلة التحقيق في بنية الخلية ووظيفته من خلال دمج الخلايا التي تحتوي على البروتينات الموسومة meGFP وmScarlet.
ينتج فيوجن في مضاعفة من عدد مركزية داخل heterokaryons مرئية على الأقل أربعة بؤر المواد ما حول الوسطى عندما يتم وضع علامة فلورية المكون حول مركزية 1 NEDD1. يسمح دمج الخلايا مع الجذر الفلوري بشكل داخلي الموسومة بالخلايا الأصلية لكل سنتيروزوم أن يتم تحديدها في هيتروكاريون. يوضح هذا البروتوكول كيفية دمج خطوط الخلايا المسماة بشكل تفاضلي وكيفية تصوير أعضائها لفهم بنيتها ووظيفتها.
وهذا البروتوكول القوي سهل نسبياً وغير مكلف نسبياً في تنفيذه مقارنة بالطرق المماثلة. يمكن استخدام هذه التقنية لطرح مجموعة من الأسئلة مثل كيفية تنظيم الانصهار العضدي وكيف تستجيب الخلايا للتغيرات في عدد الأعضاء دون الخلوية.
