Трудность культуры Campylobacter препятствует фундаментальным исследованиям, таким как, как мало бактерий, необходимых для производства болезни. Эти комбинированные аналитические и надуманные образцы, используемые здесь, могут решить эту проблему. Этот метод позволяет клинические соответствующие симптомы пациента, чтобы быть коррелированы с положительным результатом фекальной культуры и в первый раз, фактическое количество бактерий.
Изучение того, сколько бактерий коррелирует с болезнью, обеспечит диагностику, важную цель для обнаружения и твердый метод для сравнения вирулентности между штаммами или видами Campylobacter. Культура Campylobacter проста, но она требует быстрой и организованной подготовки для поддержания количественной жизнеспособности. Значительное суждение также необходимо определить колонии Campylobacter среди конкурирующих фекальной флоры на тарелке.
Перед началом культуры C.jejuni или C.coli на надеть перчатки, лабораторное пальто и защитные очки, а также поместить одноразовый защитный лист в дезинфицированный ламинарный капюшон безопасности потока. Используя стерильную технику полоса каждый гидратированных или талых бактериальных запасов на Campylobacter конкретных агар пластины и место пластины на 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов в анаэробной банке, содержащей микроэробный газ атмосферы генерации пакетика. 24 часа спустя, свободно покрыть колбу бульона BHI и поместить колбу в новую анаэробную банку с пакетиком, который будет производить микроэробной среде для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию.
На следующее утро используйте три миллилитров предварительно уменьшенного бульона и инокуляции петли, чтобы соскребать стартовую тарелку культуры Campylobacter. Перенесите суспензию в стерильную трубку и привитие оставшихся 97 миллилитров предварительно уменьшенного бульона с тремя миллилитров соскобленные суспензии. Поместите бульон в банку с газовым пакетиком и инкубировать культуру при 37 градусах Цельсия и 115 оборотов в минуту на трясущимся инкубаторе в течение 48-72 часов, пока культура не достигнет оптической плотности в 600 нанометров не более 4.
Для установления количества бактерий в этой чистой биржевой культуре выполняют восемь 10-кратной серии разбавления 100 микролитров бульона в 900 микролитров разбавления. Используя стерильные покрытие бисера, распространение 100 микролитров один раз от 10 до отрицательной пятой до 10 до отрицательных седьмых разбавлений на дубликаты предварительно уменьшенных Campylobacter конкретных пластин и этикетки пластин с концентрацией разбавления перед размещением пластин во второй анаэробной банке с газом генерации пакет на 48 до 72 часов при 37 градусов по Цельсию. В конце периода роста выберите пластины с от 30 до 300 колоний для подсчета.
После подсчета использовать подсчеты для определения колонии формирования единиц на миллилитр культуры бульона в соответствии с формулой. Очень важно, чтобы аналитические подсчеты колонии были точными, поскольку это лежит в основе всех шагов с использованием шипами фекального пула. Сразу же после покрытия для подсчета, как попродемонстрировано, смешать равные объемы бульона и Campylobacter отрицательный фекальный бассейн и сделать девять последующих двукратных разбавления в отрицательном фекальный бассейн, добавив контрольную тарелку с бульоном, не содержащим Campylobacter в фекальный бассейн, чтобы помочь определить не-Campylobacter колоний.
Полоса 10 микролитров каждого Campylobacter стул разбавления на дубликат предварительно сокращенных Campylobacter конкретных пластин агара и инкубировать пластины в анаэробной банке с газом генерации пакетика при 37 градусов по Цельсию в течение примерно 48 часов. В конце инкубации визуально изучить полосатые пластины для колоний, напоминающих те из чистых культур Campylobacter. Чтобы подтвердить, что колонии на самом деле Campylobacter выбрать несколько Campylobacter как колонии для грамма окрашивания и визуализировать тонко полосатый области световой микроскопии с помощью масляного погружения объектив для выявления грамотрицательных изогнутых, спираль, или сигары формы мелких бактерий.
Отрицательная контрольная пластина без добавления Campylobacter имеет важное значение для выявления других фекальных флоры. Рассмотрим последнее разбавление, которое содержит визуальный Campylobacter-как грам-отрицательная колония предел обнаружения культуры. И использовать формулу для расчета колонии формирования единиц на миллилитр положительного разбавления в надуманных клинических фекальных образца.
Для определения жизнеспособности Campylobacter, хранящегося в транспортной среде, смешайте один миллилитр культуры бульона Campylobacter с одним миллилитром отрицательного фекального бассейна и приготовьте 10 дубликатов двукратных серийных разбавлений в отрицательном фекальной пуле. Дальнейшее разбавление каждого разбавления при дополнительном соотношении один к четырем в cary-Blair среды и хранить 20 разбавленных труб и отрицательный контроль в Кэри-Блэр среды в крышке труб при двух до восьми градусов по Цельсию в течение 96 часов. Начиная с нуля и каждые 24 часа после этого полоса 10 микролитер aliquots каждого разбавления на Кампилобактер селективных агар пластин и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов.
Поскольку нет независимого метода для установления точных бактериальных чисел из образцов пациентов два одновременных измерения могут быть сделаны с одним чистым бактериальным запасом. Один тест используется для визуального обнаружения колоний Campylobacter от серийных разбавлений стоков бактерий в фекальной матрице, имитируя клинические образцы. Другой тест используется аналитически, количественно колонии формирования единиц на миллилитр присутствует в той же культуре запасов бактерий, используемых для пики.
Ключевым параметром успеха является определение точного размера колоний среди конкурирующих фекальной флоры, о чем свидетельствует эта репрезентативная пластина шипами культуры стула. Здесь можно наблюдать типичные данные семи независимых экспериментов. Достаточно просто определить колонии, напоминающие Кампилобактер в фекальных культурах.
Все колонии должны быть подтверждены с грам пятно или более продвинутые методы. Мы используем фермент иммуноанализ, который является более точным, чем культура для обнаружения необычных видов, таких как C.upsaliensis или C.lari, которые растут плохо на стандартных антибиотиков, содержащих агар. Этот метод закладывает необходимую основу для изучения таких вещей, как не симптоматическая перевозка Campylobacter и ли высокие бактериальные нагрузки поставить пациента на более высокий риск серьезных последствий инфекции Campylobacter.
Всегда носите СИЗ при работе с бактериями, которые часто являются инфекционными и могут быть опасными, и с отрицательным фекальным бассейном, который может содержать неизвестные патогены даже при сборе у здоровых доноров.
