Это первый протокол для одновременной и эффективной очистки и культуры первичных глазных и спинномозговых моторных нейронов эмбриональных мышей. Это позволяет изучать механизмы, лежащие в основе болезни моторных нейронов. Этот протокол добавляет новый компонент культуры экстракорпорального окуломотора к существующим системам и обеспечивает чистые виды и возрастные культуры спинномозговых моторных нейронов для сравнения.
При боковом амиотрофном склерозе спинномозговые моторные нейроны вырождаются, в то время как окуломоторные нейроны относительно избавлены. Сравнение этих культур может дать представление о механизме заболевания и терапии. Этот метод облегчит изучение механизмов, лежащих в основе развития моторных нейронов, болезней и избирательной уязвимости.
Наша культурная система позволяет характеристика морфологии моторных нейронов, молекулярной биологии и электрофизиологии. Для тех, кто является новым для этой техники, мы рекомендуем много практики. Рассечение может быть технически сложным и несколько вскрытий может потребоваться для получения достаточного количества нейронов для первичной культуры.
Начните с сбора положительных эмбрионов Islet1 EGF у беременной мыши примерно через 11,5 дней после оплодотворения. Спрей живота тщательно с этанолом и удалить матку с стерильными ножницами микроперепись и большой палец соусом миппы. Кратко мыть матку в стерильных PBS.
Затем перенесите его на пластину вскрытия, наполненную предварительно охлажденным стерильным PBS. Под ярким светом микроскопа, тщательно удалить эмбрионы из матки с помощью микродиссекции ножницы, большой палец соусом миппы, и Дюмон 5 пинцетом. Затем используйте стерильные Мория мини перфорированной ложкой для передачи каждого эмбриона в отдельный колодец 24-хорошо пластины заполнены предварительно охлажденной спячки E низкой флуоресценции среды дополняется 1X V27.
Сохраняя пластину на льду, перенесите один эмбрион на стерильную пластину вскрытия и полностью покройте его ледяным стерильным раствором соли Хэнка или HBSS. Используйте пинцет для удаления лица эмбриона и хвоста, не повреждая середину. Затем поместите эмбрион склонны с конечностями оседлал и хвост, указывающий на передней части микроскопа.
Используйте пинцет, чтобы разрезать крышу четвертого желудочка для того, чтобы создать небольшое отверстие. Используйте это отверстие, чтобы подключить пинцет в пространство, созданное между четвертым желудочком и его крышей. Рассекаете вдоль спинной поверхности эмбриона ростральной коры и боковой на пол пластины и моторной колонки.
Затем откройте вскрытую ткань в открытой книге образом, чтобы выявить GFP положительные ядра CN3 и CN4. Тщательно отделить брюшной мидбрайн от эмбриона и удалить менингеальной ткани с пинцетом и микродиссекционного ножа. Рассекаете двусторонние GFP положительные ядра CN3 и CN4 вдали от пластины пола и других GFP положительных окружающих тканей, заботясь, чтобы избежать прикосновения или повреждения нейронов.
При сборе отдельных ядер CN3 и CN4, вырезать вдоль среднего мозга этих двух ядер и использовать P1000 пипетку для сбора вскрытой брюшной ткани среднего мозга с минимальным HBSS. Поместите его в помеченную 1,7 миллилитр микроцентрифугную трубку, наполненную средой вскрытия, и храните трубку на льду до диссоциации. Продолжайте вытаскивать желудочковые средние мозги из дополнительных эмбрионов в той же трубке до тех пор, пока общее число не будет соответствовать экспериментальным требованиям.
Чтобы вскрыть брюшной спинной мозг, держите эмбрион склонны с головой лицом к передней части микроскопа. Держите его одной парой пинцета и вставьте кончик другой пары в неоткрытую хвостовую часть четвертого желудочка. Откройте остальную часть заднего мозга и спинного мозга спинно над всей розтрокода степени эмбриона.
Вырезать спинной ткани, начиная с четвертого желудочка и работает в направлении центрального канала хвостового спинного мозга, используя миппы в качестве ножниц. Затем удерживайте эмбрион одним набором пинцета и ущипните лоскут спинной ткани с каждой стороны с другой парой. Удалите брюшной спинной мозг с помощью микродиссекционного ножа, чтобы пробить непосредственно под GFP положительный SMN подъема брюшного спинного мозга с пилой, как движения с обеих сторон.
Отрежьте спинной мозг поперечно на верхней границе нижней конечности и удалите поясничную часть шейки матки. Вырезать поперечно непосредственно над C1, где первый GFP положительные передние рога проектов. Поместите спинную сторону брюшного спинного мозга вверх и удерживайте ее, нажав на отрицательную ткань GFP между колонками GFP positive SMN парой пинцетов.
Удалите оставшийся прикрепленный мезенхим, DRG и спинной спинной мозг, обрезая обе стороны колонки GFP positive SMN с помощью микропереписьного ножа. Используйте P1000 пипетку для сбора вскрытой ткани спинного мозга с минимальным HBSS и поместите его в помечены 1,7 миллилитров микроцентрифуг трубки заполнены вскрытия среды. Храните его на льду до диссоциации и продолжайте вытягивать брюшной спинной мозг из дополнительных эмбрионов в той же трубке.
Добавьте соответствующий объем раствора папаина к каждой из трубок микроцентрифуга с вскрытыми образцами тканей. Инкубировать трубки при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут агитации труб каждые 10 минут пальцем стряхивая. После инкубации аккуратно тритурировать каждую подвеску восемь раз с помощью пипетки P200 и центрифугировать ее 300 раз г в течение пяти минут.
Resuspend клеточных гранул с соответствующим объемом альбумин овомукоид ингибитор раствора, мягко трубы вверх и вниз. Повторите центрифугу. Затем аккуратно удалите супернатант с помощью пипетки P1000.
Повторное увеличение ячеек в соответствующем объеме среды вскрытия. Фильтр подвески через 70 микрометровый ситечко клетки. Далее используйте сортировку FACS для изоляции положительных ячеек GFP, вскрытых из CN3/CN4 и SMN.
Разбавить изолированные клеточные суспензии с моторной нейронной культуры среды предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию до соответствующей плотности и добавить 200 микролитров подвески в колодец PDL ламинин покрытием 96-хорошо пластины. Культура нейронов в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа инкубатор убедившись, чтобы обновить двигатель нейронов культуры среды каждые пять дней. Когда успешно изолированные нейроны были выращены в культуре, почти чистые первичные культуры CN3/CN4 и SMN были получены и поддерживаются в течение 14 дней в пробирке.
Чистота культур в течение двух дней в пробирке составила 93,5% для CN3/CN4 и 86,7% для SMN при оценке иммуноцитохимии с моторным маркером нейронов Islet1 и нейрональным маркером TUJ1. Чистота в значительной степени зависит от возраста эмбрионов и от установления соответствующих пороговых значений для ворот GFP во время FACS. Чистота нейронов, изолированных от эмбрионов E10.5, была сопоставима с эмбрионами E11.5.
Тем не менее, чистота значительно снизилась, когда E13.5 эмбрионы были использованы. Чтобы определить, если первичные CN3/CN4s и SMNs показали дифференциальные реакции на эндоплазмические стрессоры стикулум, клетки были обработаны с различной концентрацией циклопиазоновой кислоты или CPA в течение двух дней в пробирке и фиксированной три дня спустя для иммуноцитохимии для оценки коэффициентов выживаемости. Было подсчитано количество жизнеспособных нейронов в каждой выборке и рассчитаны коэффициенты выживаемости.
Монокультуры CN3/CN4 были значительно более устойчивы к лечению CPA по сравнению с монокультурами SMN. После этой процедуры, многие дополнительные методы могут быть выполнены для изучения моторных нейронов. Несколько примеров включают исследования электрофизиологии, клеточной биологии, транскрипции или доступности хроматина.
