从产前Isl^mn:GFP转基因小鼠的奥库罗运动、特罗赫利尔和脊柱运动神经元的分离与培养

这是第一个同时有效地从胚胎小鼠中纯化和培养原眼和脊髓运动神经元的协议。它能够研究运动神经元疾病背后的机制。该协议为现有系统添加了一种新的体外奥体运动培养成分，并提供纯物种和年龄匹配的脊柱运动神经元培养物进行比较。

在肌萎缩性侧质硬化症中，脊髓运动神经元退化，而腹膜运动神经元相对幸免。比较这些文化可以提供对疾病机制和治疗的见解。这种方法将有助于研究运动神经元发展、疾病和选择性脆弱性背后的机制。

我们的培养系统能够对运动神经元形态学、分子生物学和电生理学进行表征。对于这些新到的技术，我们建议大量的练习。解剖在技术上具有挑战性，可能需要多个解剖器才能获得足够的原培养神经元。

从从怀孕小鼠收获 Islet1 EGF 阳性胚胎开始，大约在受精后 11.5 天。用乙醇彻底喷洒腹部，用无菌的微切除剪刀和拇指敷料钳切除子宫。在无菌 PBS 中短暂清洗子宫。

然后将其转移到充满预冷藏无菌PBS的解剖板。在显微镜的明亮光线下，用微切除剪刀、拇指敷料钳和杜蒙5钳子小心地从子宫中取出胚胎。然后使用无菌的 Moria 迷你穿孔勺将每个胚胎转移到一个 24 井板的单独井中，该井内装满了预冷冬眠 E 低荧光介质，并辅以 1X V27。

在冰上保持板的同时，将一个胚胎转移到无菌解剖板中，用冰冷无菌汉克的平衡盐溶液或HSS完全覆盖。使用钳子去除胚胎和尾巴的脸部，而不会损坏中脑。然后将容易受伤的胚胎放在显微镜的前面，四肢交叉，尾巴指向。

使用钳子切开第四个心室的屋顶，以产生一个小开口。使用此开口将钳子钩入第四个心室与其屋顶之间的空间。沿着胚胎的后表面解剖到皮层，侧向底板和运动柱。

然后以开放书的方式打开解剖组织，以显示GP阳性CN3和CN4核。小心地将腹间中脑从胚胎中分离，用钳子和微解刀取出脑膜组织。将双边 GFP 阳性 CN3 和 CN4 核从地板和其他 GFP 阳性周围组织中解剖，以避免接触或损坏神经元。

如果收集单独的CN3和CN4核，沿着这两个核的中脑切割，并使用P1000移液器收集解剖的腹中脑组织与最小的HSS。将其放在标有 1.7 毫升的微离心管中，并填充解剖介质，将管存放在冰上，直到分离。继续从同一管中的其他胚胎中拉出腹中脑，直到总数满足实验要求。

要解剖腹脊髓，请让胚胎容易头部朝向显微镜前部。用一对钳子握住它，并将另一对的尖端插入第四个心室未开封的孔道部分。在胚胎的整个玫瑰花中打开其余的后脑和脊髓。

切开从第四心室开始的后体组织，然后用钳子作为剪刀向骨脊髓的中央运河工作。然后用一组钳子握住胚胎，用另一对捏掉两侧的支骨组织皮瓣。使用微切除刀将腹脊髓切开，以穿透直接下方的 GFP 正 SMN，用锯形运动抬起腹脊髓。

在下肢上部边缘横向切割脊髓，切除颈椎部分。直接在 C1 上方横向切割，其中第一个 GFP 正前喇叭项目。将腹脊髓后侧向上放置，用一对钳子在 GFP 阳性 SMN 柱之间按压 GFP 负组织，握住它。

使用微切除刀修剪 GFP 正 SMN 柱的两侧，去除剩余的附着的微子、DRG 和后侧脊髓。使用 P1000 移液器收集用最少的 HBSS 进行解剖的腹膜组织，并放在标有 1.7 毫升的微离心管中，并填充了解剖介质。将其储存在冰上，直到分离，并继续从同一管中的其他胚胎中提取腹脊髓。

将适当体积的木瓜溶液添加到每个微离心管中，并加入解剖组织样本。在37摄氏度下孵育管子30分钟，用手指轻拂每10分钟搅拌一次管子。孵育后，用P200移液器轻轻三联，以300次g离心5分钟。

通过轻轻上下移液，用适当体积的白蛋白 ovomucoid 抑制剂溶液重新吸收细胞颗粒。重复离心。然后用 P1000 移液器小心地取出上流液。

在适当的解剖介质中重新暂停细胞。通过 70 微米电池滤株过滤悬浮液。接下来，使用 FACS 排序来分离从 CN3/CN4 和 SMN 解剖的 GFP 阳性细胞。

用运动神经元培养介质将分离的细胞悬浮液提前加热至37摄氏度，达到适当的密度，并将200微升悬浮液添加到PDL层压层涂层的96井板的井中。培养37摄氏度和5%二氧化碳培养箱中的神经元，确保每五天刷新一次运动神经元培养基。当成功分离的神经元在培养中生长时，几乎纯原发性CN3/CN4和SMN培养物在体外得到并维持了14天。

使用运动神经元标记岛1和神经元标记TUJ1的免疫细胞化学评估，在体外两天的培养物的纯值为93.5%，SMN为86.7%。在FACS期间，这些卵子在很大程度上依赖于胚胎的年龄和为GPC门设置适当的阈值。从E10.5胚胎中分离出的神经元的纯度与E11.5胚胎的纯度相当。

然而，当E13.5胚胎被使用时，纯度显著下降。为了确定原发性CN3/CN4和SMN是否对内质性神经质应激反应有差异反应，细胞在体外两天以不同浓度的环状酸或CPA治疗，三天后固定用于免疫细胞化学，以评估存活率。计算每个样本中可行神经元的数量并计算存活率。

与SMN单一栽培相比，CN3/CN4单一栽培对CPA治疗的耐药性明显增强。按照此过程，可以执行许多其他方法来检查运动神经元。一些例子包括电生理学、细胞生物学、转录或染色质可访问性的研究。