هذا هو البروتوكول الأول لتنقية في وقت واحد وكفاءة والثقافة الأولية الخلايا العصبية الحركية العينية والعمود الفقري من الفئران الجنينية. فإنه يتيح دراسة الآليات الكامنة الكامنة في مرض الخلايا العصبية الحركية. يضيف هذا البروتوكول رواية في المختبر oculomotor مكون الثقافة إلى النظم القائمة ويوفر الأنواع النقية والعمر مطابقة ثقافات الخلايا العصبية الحركية الشوكية للمقارنة.
في التصلب الجانبي الضموري، تتدهور الخلايا العصبية الحركية الشوكية بينما يتم تجنيب الخلايا العصبية oculomotor نسبيا. ويمكن مقارنة هذه الثقافات أن توفر رؤى في آلية المرض والعلاج. هذه الطريقة سوف تسهل الدراسات الآليات الكامنة في تطوير الخلايا العصبية الحركية, المرض, والضعف الانتقائي.
نظامنا الثقافي يتيح توصيف مورفولوجيا الخلايا العصبية الحركية، والبيولوجيا الجزيئية، والفيزيولوجيا الكهربائية. بالنسبة لأولئك جديدة لهذه التقنية، ونحن نوصي الكثير من الممارسة. تشريح يمكن أن يكون تحديا من الناحية الفنية، وقد تكون هناك حاجة تشريح متعددة للحصول على الخلايا العصبية الكافية للثقافة الأولية.
تبدأ بحصاد EGF الأجنة الإيجابية من فأرة حامل ما يقرب من 11.5 يوما بعد الإخصاب. رش البطن جيدا مع الإيثانول وإزالة الرحم مع مقص microdissection العقيمة والإبهام خلع ملقط. غسل لفترة وجيزة الرحم في برنامج تلفزيوني عقيم.
ثم نقله إلى لوحة التشريح مليئة برنامج تلفزيوني معقم متجمدة مسبقاً. تحت الضوء الساطع للمجهر، قم بإزالة الأجنة بعناية من الرحم باستخدام مقص microdissection، ملقط خلع الإبهام، وملاقط دومون 5. ثم استخدام ملعقة موريا مثقوبة صغيرة معقمة لنقل كل جنين إلى بئر منفصلة من لوحة 24-well مليئة السبات قبل مبردة E منخفضة فلورينسيس مكملة مع 1X V27.
مع الحفاظ على لوحة على الجليد، ونقل الجنين واحد إلى لوحة تشريح العقيمة وتغطية تماما مع الجليد الباردة المعقمة هانك حل الملح المتوازن أو HBSS. استخدم ملاقط لإزالة وجه الجنين وذيله دون إتلاف منتصف الفقرات. ثم ضع الجنين عرضة مع أطرافه تمتد وذيل يشير نحو الجزء الأمامي من المجهر.
استخدام ملاقط لفتح فتح سقف البطين الرابع من أجل توليد فتحة صغيرة. استخدم هذا الفتح لربط الملاقط في المساحة التي تم إنشاؤها بين البطين الرابع وسقفه. تشريح على طول السطح الظهري للجنين إلى القشرة الجانبية إلى لوحة الأرض وعمود المحرك.
ثم فتح الأنسجة تشريح بطريقة كتاب مفتوح للكشف عن CN3 إيجابية GFP والنوى CN4. قم بفصل منتصف البطن البطني عن الجنين بعناية وإزالة الأنسجة السحابية باستخدام الملاقط وسكين الميكروفيسي. تشريح ثنائي GFP إيجابية CN3 والنيات CN4 بعيدا عن لوحة الأرض وغيرها من الأنسجة المحيطة GFP إيجابية مع الحرص على تجنب لمس أو إتلاف الخلايا العصبية.
إذا جمع CN3 منفصلة والنوى CN4, قطع على طول منتصف فيرين من هذه النوى اثنين واستخدام ماصة P1000 لجمع أنسجة منتصف البطن تشريح مع الحد الأدنى HBSS. وضعه في أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر المسمى مليئة المتوسطة تشريح وتخزين الأنبوب على الجليد حتى تفكك. استمر في سحب الكبرات الوسطى البطنية من أجنة إضافية في نفس الأنبوب حتى يفي العدد الإجمالي بالمتطلبات التجريبية.
لتشريح الحبل الشوكي البطني، حافظ على عرضة الجنين مع الرأس الذي يواجه واجهة المجهر. عقد مع زوج واحد من ملاقط وأدخل غيض من الزوج الآخر في الجزء السدي غير مفتوحة من البطين الرابع. فتح بقية hindbrain والحبل الشوكي dorsally على مدى كامل rostrocaudal من الجنين.
قطع الأنسجة الظهرية بدءا من البطين الرابع والعمل نحو القناة المركزية للنخاع الشوكي السد باستخدام ملقط كمقص. ثم عقد الجنين مع مجموعة واحدة من ملاقط وقرصة قبالة رفرف من الأنسجة الظهرية على كل جانب مع الزوج الآخر. إزالة الحبل الشوكي البطني باستخدام سكين microdissection للثقب مباشرة تحت SMN إيجابية GFP رفع الحبل الشوكي البطني مع حركات تشبه المنشار على كلا الجانبين.
قطع الحبل الشوكي بشكل مستعرض عند الحدود العليا للجزء السفلي وإزالة الجزء القطني العنقي. قطع عرضية مباشرة فوق C1 حيث أول مشاريع إيجابية القرن الأمامي GFP. ضع جانب الحبل الشوكي البطني الظهري لأعلى واحمله بالضغط على النسيج السلبي GFP بين أعمدة SMN الإيجابية GFP مع زوج من الملاقط.
إزالة ما تبقى من mesenchyme المرفقة، DRGs، والنخاع الشوكي الظهر عن طريق تقليم كلا الجانبين من العمود SMN إيجابية GFP مع سكين microdissection. استخدام ماصة P1000 لجمع أنسجة الحبل الشوكي البطني تشريح مع الحد الأدنى HBSS ووضعها في أنبوب microcentrifuge 1.7 ملليلتر المسمى مليئة المتوسطة تشريح. تخزينه على الجليد حتى التفكك ومواصلة سحب الحبال الشوكية البطنية من الأجنة إضافية في نفس الأنبوب.
إضافة حجم مناسب من حل باباين إلى كل من أنابيب microcentrifuge مع عينات الأنسجة تشريح. احتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة يهيج الأنابيب كل 10 دقائق عن طريق الخفقان الاصبع. بعد الحضانة، tri بلطف كل تعليق ثماني مرات مع ماصة P200 والطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
Resuspend الكريات الخلية مع حجم مناسب من حبوب اللبوجين مانع ovomucoid حل عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. كرر الطرد المركزي. ثم إزالة بعناية فائقة مع ماصة P1000.
إعادة تعليق الخلايا في الحجم المناسب من وسيلة تشريح. تصفية التعليقات من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70. بعد ذلك، استخدم الفرز FACS لعزل الخلايا الإيجابية GFP تشريح من CN3/CN4 وSMN.
تمييع تعليق الخلية المعزولة مع ثقافة الخلايا العصبية الحركية المتوسطة درجة حرارة مسبقة إلى 37 درجة مئوية إلى الكثافة المناسبة وإضافة 200 ميكرولترات من التعليق إلى بئر من لوحة PDL المغلفة باللامينين 96-well. ثقافة الخلايا العصبية في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ التأكد من تحديث ثقافة الخلايا العصبية الحركية المتوسطة كل خمسة أيام. عندما نمت الخلايا العصبية المعزولة بنجاح في الثقافة، تم الحصول على الثقافات CN3/CN4 الأولية النقية تقريباً وSMN والاحتفاظ بها لمدة 14 يوماً في المختبر.
وكانت النقوش من الثقافات في يومين في المختبر 93.5٪ ل CN3/CN4 و 86.7٪ لSMN عند تقييمها بواسطة الكيمياء المناعية مع علامة الخلايا العصبية الحركية 1 وعلامة الخلايا العصبية TUJ1. واعتمدت النقّاء اعتماداً كبيراً على عمر الأجنة وعلى تحديد العتبات المناسبة لبوابات برنامج الأغذية العالمي أثناء وجود القوات المسلحة الكونغولية. كانت نقاء الخلايا العصبية المعزولة من الأجنة E10.5 مماثلة لتلك التي في الأجنة E11.5.
ومع ذلك، انخفض النقاء بشكل كبير عندما تم استخدام الأجنة E13.5. لتحديد ما إذا كان CN3/CN4s الأولية وSMNs أظهرت استجابات تفاضلية للإجهاد إندوبلاسميك، تم التعامل مع الخلايا مع تركيزات متفاوتة من حمض سيكلوبيازون أو CPA في يومين في المختبر وثابتة بعد ثلاثة أيام للكيمياء المناعية لتقييم نسب البقاء على قيد الحياة. تم حساب عدد الخلايا العصبية القابلة للحياة في كل عينة وتم حساب نسب البقاء على قيد الحياة.
كانت الاستزراع أحادي CN3/CN4 أكثر مقاومة بشكل ملحوظ لعلاج CPA مقارنة بزراعة الـ SMN الأحادية. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ العديد من الطرق الإضافية لفحص الخلايا العصبية الحركية. وتشمل بعض الأمثلة دراسات في علم الفيزيولوجيا الكهربائية، وبيولوجيا الخلية، والنسخ، أو إمكانية الوصول إلى الكروماتين.
